蛋白磷酸酶4在IL-6誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：2型糖尿病是糖尿病的主要類型，占糖尿病患者的90％以上。2型糖尿病的病理生理特點(diǎn)是胰島素分泌不足或利用障礙。慢性炎癥不僅是糖尿病伴隨的特征之一，也是引發(fā)糖尿病的重要因素之一。2型糖尿病患者促炎因子水平大量升高，而其中的IL-6表現(xiàn)出與胰島素抵抗和2型糖尿病有強(qiáng)烈的相關(guān)性。并且IL-6水平的升高與血糖升高、糖耐量降低和胰島素敏感性降低高度相關(guān)。蛋白磷酸酶4(Proteinphosphatase4，PP4)是PP2A家族的重要成員。它

2、參與調(diào)節(jié)許多重要的細(xì)胞進(jìn)程，并與胰島素受體底物4(Insulinreceptor4，IRS4)的降解和肝糖代謝有關(guān)。本研究旨在通過建立IL-6誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗的細(xì)胞和動(dòng)物模型，分析肝細(xì)胞或肝臟組織中PP4表達(dá)及活性的變化，探討PP4在IL-6誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗中的作用及其機(jī)制。
　　 方法：IL-6(10ng/ml)分別處理人肝癌細(xì)胞系HepG2和C57BL/6小鼠原代肝細(xì)胞18h和15h，建立胰島素抵抗的肝細(xì)胞模型；在C

3、57BL/6小鼠背部皮下埋植IL-6(18pg/kg-day)緩釋泵處理6～9天，建立IL-6誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗動(dòng)物模型。用G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PP4表達(dá)質(zhì)粒HA-PP4和轉(zhuǎn)染PP4活性抑制突變體質(zhì)粒FLAG-PP4RL的HepG2細(xì)胞克隆；應(yīng)用PP4-siRNA及PP4-shRNA干擾HepG2細(xì)胞與原代肝細(xì)胞中PP4的表達(dá)，獲得PP4低表達(dá)的HepG2細(xì)胞和原代肝細(xì)胞；構(gòu)建PP4-shRNA腺病毒載體，通過尾靜脈注射C57BL

4、/6小鼠和db/db小鼠，建立肝臟PP4低表達(dá)的動(dòng)物模型。測(cè)定小鼠血糖、血脂和胰島素水平。用葸酮法檢測(cè)細(xì)胞和肝臟組織中的糖原水平，Real-timePCR測(cè)定糖異生相關(guān)基因(G6Pase、PEPCK、PGCl-α)的表達(dá)，Westernblot分析細(xì)胞或肝臟組織胰島素信號(hào)通路中JNK、P-JNK、IRS1、P-IRS1、AKT、P-AKT、GSK、P-GSK和PP4的水平，用免疫沉淀結(jié)合絲/蘇氨酸磷酸酶活性分析法測(cè)定PP4的活性。免疫共

5、沉淀結(jié)合Westernblot檢測(cè)PP4與IRS-1的相互作用。
　　 結(jié)果：1．我們首先以2型糖尿病小鼠-db/db小鼠（C57BL/6背景）為胰島素抵抗模型，檢測(cè)到血糖、胰島素和IL-6水平顯著升高，而胰島素敏感指數(shù)(IsI)降低。蒽酮法的檢測(cè)結(jié)果顯示肝組織糖原含量顯著降低，Westernblot結(jié)果表明糖原合成和糖異生相關(guān)信號(hào)通路受損：JNK的磷酸化和IRS-1的307-Ser磷酸化水平增強(qiáng)，而GSK、AKT的磷酸化水平下

6、降，同時(shí)伴有IRS-1表達(dá)下降及PEPCK表達(dá)增加。這些結(jié)果表明db/db小鼠的肝臟發(fā)生了明顯的胰島素抵抗。我們還觀察到db/db小鼠肝組織中PP4的表達(dá)和活性均顯著增強(qiáng)，提示PP4可能參與了肝臟胰島素抵抗的發(fā)生。在體外試驗(yàn)中，我們采用10ng/mlIL-6分別處理HepG2細(xì)胞和C57BL/6小鼠原代肝細(xì)胞18h和15h，建立胰島素抵抗細(xì)胞模型。在這兩種細(xì)胞的胰島素抵抗模型中，糖原含量顯著下降，糖異生相關(guān)基因表達(dá)增加，細(xì)胞的糖原合成信

7、號(hào)通路受損。Westernblot和磷酸酶活性分析結(jié)果顯示PP4的表達(dá)和活性均增強(qiáng)。在IL-6誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠胰島素抵抗動(dòng)物模型中，血清胰島素水平升高，ISI降低，肝臟組織中糖原含量顯著下降，糖異生相關(guān)基因(G6Pase.PEPCK、PGCI-α)的mRNA水平升高。肝臟組織的糖原合成信號(hào)通路受損。同時(shí)肝臟組織PP4的表達(dá)和活性增強(qiáng)。細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示PP4參與了IL-6誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗的發(fā)生。2．為了進(jìn)一步探討PP4

8、在IL-6誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗中的作用及機(jī)制，我們針對(duì)PP4的表達(dá)和活性，分別建立了穩(wěn)定高表達(dá)PP4以及PP4活性被抑制的HepG2細(xì)胞克隆，應(yīng)用PP4-siRNA及PP4-shRNA獲得PP4低表達(dá)的HepG2細(xì)胞和原代肝細(xì)胞以及肝臟PP4低表達(dá)的C57BL/6小鼠。這些細(xì)胞和動(dòng)物的分析結(jié)果表明：①PP4高表達(dá)的HepG2細(xì)胞中糖原含量降低，糖原合成信號(hào)通路受損；②PP4表達(dá)降低可以增加IL-6誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞、原代肝細(xì)胞以及C5

9、7BL/6小鼠肝臟中的糖原含量，降低IL-6誘導(dǎo)的糖異生相關(guān)基因表達(dá)；③抑制PP4活性，HepG2細(xì)胞的糖原合成增加，糖原合成信號(hào)通路得以恢復(fù)。此外，免疫共沉淀及免疫熒光的結(jié)果顯示，PP4與IRS-1共定位，并存在著相互調(diào)節(jié)作用。這種相互調(diào)節(jié)可能在IL-6誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗中起關(guān)鍵作用。3．為了進(jìn)一步明確PP4在db/db小鼠胰島素抵抗發(fā)生中的作用，我們通過PP4-shRNA腺病毒載體降低db/db小鼠肝臟組織中PP4的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)

10、db/db小鼠血糖水平下降，糖耐量增強(qiáng)，糖異生減少，有效減弱了db/db小鼠的胰島素抵抗。
　　 結(jié)論：1．在肝胰島素抵抗的細(xì)胞和動(dòng)物模型中，PP4的表達(dá)和活性均顯著增強(qiáng)；2．PP4是IL．6信號(hào)通路的正調(diào)控因子，促進(jìn)IL-6誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗的發(fā)生：3．PP4通過兩種方式參與IL-6誘導(dǎo)的胰島素抵抗。一方面，通過激活JNK抑制胰島素信號(hào)通路；另一方面，可能通過與IRS-1直接作用而調(diào)節(jié)IL-6誘導(dǎo)的胰島素抵抗。4．PP4表達(dá)