蛋白磷酸酶4在TNF-α誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:蛋白磷酸酶4(Protein phosphatase4，PP4)是PP2A家族的重要成員，參與調(diào)節(jié)許多重要的細(xì)胞進(jìn)程，如中心體的成熟、微管的組織和生長(zhǎng)、DNA損傷修復(fù)，并與胰島素受體底物4(Insulin receptor4，IRS4)的降解和肝糖代謝有關(guān)。本研究通過建立TNF-α誘導(dǎo)的胰島素抵抗的細(xì)胞和動(dòng)物模型，分析細(xì)胞或肝臟組織中PP4的表達(dá)及活性的變化，探討PP4在TNF-α誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗中的作用及其機(jī)制。
　　

2、 方法:TNF-α(10ng/ml)刺激人肝癌細(xì)胞系HepG2和C57BL/6小鼠原代肝細(xì)胞24h，建立胰島素抵抗的細(xì)胞模型;C57BL/6小鼠背部皮下埋植TNF-α(8μg/kg·day)緩釋泵處理7天，建立TNF-α誘導(dǎo)的胰島素抵抗動(dòng)物模型。用G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PP4高表達(dá)質(zhì)粒HA-PP4和轉(zhuǎn)染PP4活性抑制突變體質(zhì)粒FLAG-PP4RL的HepG2細(xì)胞克隆;應(yīng)用PP4-siRNA及PP4-shRNA干擾HepG2細(xì)胞與原代

3、肝細(xì)胞中PP4的表達(dá)，獲得PP4低表達(dá)的HepG2細(xì)胞和原代肝細(xì)胞;構(gòu)建PP4-shRNA腺病毒載體，通過尾靜脈注射C57BL/6小鼠，建立肝臟PP4低表達(dá)的動(dòng)物模型。測(cè)定小鼠血糖、血脂、胰島素和TNF-α水平。用蒽酮法檢測(cè)細(xì)胞和肝臟組織中的糖原水平，Real-time PCR測(cè)定糖異生相關(guān)基因(G6Pase、PEPCK、PGC1-α)的表達(dá)，Western blot分析細(xì)胞或肝臟組織胰島素信號(hào)通路中JNK、P-JNK、IRS1、P-I

4、RS1、AKT、P-AKT、GSK、P-GSK和PP4的水平，用免疫沉淀結(jié)合絲/蘇氨酸磷酸酶活性分析法測(cè)定PP4的活性。免疫共沉淀結(jié)合Western blot檢測(cè)PP4與IRS1的相互作用。
　　 結(jié)果:1.我們首先以2型糖尿病小鼠-db/db小鼠（C57BKS/J背景）為胰島素抵抗模型，檢測(cè)到血糖、胰島素和TNF-α水平顯著升高，而胰島素敏感指數(shù)(ISI)降低。蒽酮法檢測(cè)結(jié)果顯示肝組織糖原含量顯著降低，Western blot

5、結(jié)果表明糖原合成和糖異生相關(guān)信號(hào)通路受損:JNK的磷酸化和IRS1的307-Ser磷酸化水平增強(qiáng)，而GSK、AKT的磷酸化水平下降，同時(shí)伴有IRS1表達(dá)下降及PEPCK表達(dá)增加。這些結(jié)果表明db/db小鼠的肝臟發(fā)生了胰島素抵抗。我們還觀察到db/db小鼠肝組織中PP4的表達(dá)和活性均顯著增強(qiáng)，提示PP4可能參與了肝臟胰島素抵抗的發(fā)生。在體外試驗(yàn)中，我們采用10ng/mlTNF-α處理HepG2細(xì)胞和C57BL/6小鼠原代肝細(xì)胞24h，建立

6、胰島素抵抗細(xì)胞模型。在這兩種細(xì)胞的胰島素抵抗模型中，糖原含量顯著下降，糖異生相關(guān)基因表達(dá)增加，細(xì)胞的糖原合成信號(hào)通路受損: JNK的磷酸化和IRS1的307-Ser磷酸化水平升高，而GSK和AKT的磷酸化水平下降。Western blot和磷酸酶活性分析結(jié)果顯示PP4的表達(dá)和活性均增強(qiáng)。在TNF-α誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠胰島素抵抗動(dòng)物模型中，血清胰島素水平升高，ISI降低，肝臟組織中糖原含量顯著下降，糖異生相關(guān)基因（G6Pase、PE

7、PCK、PGC1-α）的mRNA水平升高。肝臟組織的糖原合成信號(hào)通路受損:IRS1和JNK的磷酸化水平顯著增加，而GSK和AKT的磷酸化水平及IRS1表達(dá)水平顯著降低。同時(shí)肝臟組織PP4的表達(dá)和活性增強(qiáng)。細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示PP4參與了TNF-α誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗的發(fā)生。2.為了進(jìn)一步探討PP4在TNF-α誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗中的作用及機(jī)制，我們針對(duì)PP4的表達(dá)和活性，分別建立了穩(wěn)定高表達(dá)PP4以及PP4活性被抑制的HepG2細(xì)胞

8、克隆，應(yīng)用PP4-siRNA及PP4-shRNA獲得PP4低表達(dá)的HepG2細(xì)胞和原代肝細(xì)胞以及肝臟PP4低表達(dá)的C57BL/6小鼠。這些細(xì)胞和動(dòng)物的分析結(jié)果表明①PP4高表達(dá)的HepG2細(xì)胞中糖原含量降低，糖原合成信號(hào)通路受損;②PP4表達(dá)降低可以使HepG2細(xì)胞、原代肝細(xì)胞以及C57BL/6小鼠中糖原含量增加，糖異生相關(guān)基因表達(dá)降低，糖原合成信號(hào)通路恢復(fù);③抑制PP4活性，HepG2細(xì)胞的糖原合成增加，糖原合成信號(hào)通路得以恢復(fù)。此外

9、，免疫共沉淀及Westernblot的結(jié)果顯示，在HepG2細(xì)胞和原代肝細(xì)胞中PP4與IRS1存在著相互調(diào)節(jié)作用。這種相互調(diào)節(jié)可能在TNF-α誘導(dǎo)的肝臟胰島素抵抗中起關(guān)鍵作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.在肝胰島素抵抗的細(xì)胞和動(dòng)物模型中，PP4的表達(dá)和活性均顯著增強(qiáng);
　　 2.PP4是TNF-α信號(hào)通路的正調(diào)控因子，促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的胰島素抵;
　　 3.PP4通過兩種方式參與TNF-α誘導(dǎo)的胰島素抵抗