環(huán)磷酸腺苷在大鼠胰島素分泌中的作用及其機(jī)制.pdf

1、目的：
　　探討腺苷酸環(huán)化酶(AC)/環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在大鼠胰島素分泌中的作用，通過(guò)使用AC激動(dòng)劑Forskolin和抑制劑SQ22536研究cAMP影響胰島素分泌的機(jī)制。
　　方法：
　　(1)處死大鼠，打開(kāi)大鼠腹腔，將膠原酶P(Collagenase P)液從胰總管打入胰腺，可看到附著在胃和小腸的胰腺，迅速剪下胰腺，將其放到38℃水浴震蕩消化11 min，采用Histopaque-1077，離心分

2、離出大鼠胰島。用DispaseⅡ消化胰島，可得到大鼠原代胰島β細(xì)胞，為了使研究結(jié)果最為接近大鼠生理狀態(tài)，以上方法分得的胰島和細(xì)胞最多使用7天。(2)DTZ染液可將胰島染成猩紅色，對(duì)其進(jìn)行染色鑒定，室溫下染色胰島10分鐘，在光學(xué)顯微鏡下觀察胰島形態(tài)。對(duì)胰島進(jìn)行活性檢測(cè)可用AO/PI染液孵育胰島，用490 nm激發(fā)光，510 nm發(fā)射光觀察。(3)得到的胰島在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，用放射性免疫分析法檢測(cè)AC激動(dòng)劑Forskolin和抑制劑S

3、Q22536對(duì)大鼠胰島素分泌及環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量的影響。(4)采用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)藥物對(duì)胰島β細(xì)胞電壓依賴(lài)性鉀通道(KV)、動(dòng)作電位(AP)的影響。(5)采用離子成像技術(shù)檢測(cè)Forskolin和SQ22536對(duì)胰島β細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)用膠原酶P，Histopaque-1077梯度離心法分得的胰島，大小不一，折光性好，直徑在100-300μm。胰島β細(xì)胞細(xì)胞呈球形，質(zhì)地光滑，表面圓潤(rùn)。(2)

4、胰島經(jīng)DTZ染色成猩紅色，顯示在以上實(shí)驗(yàn)中分離為胰島，且純度較高。95％以上的胰島經(jīng)AO/PI染色后發(fā)綠色熒光，胰島活性好。(3)在胰島素分泌實(shí)驗(yàn)中，胰島有明顯的葡萄糖依賴(lài)性的促胰島素分泌作用；在不同葡萄糖濃度下胰島素分泌的標(biāo)化值分別是：(1.00±0.38)用特異的AC激動(dòng)劑Forskolin和廣泛應(yīng)用的AC抑制劑SQ22536，在8.3mM葡萄糖的基礎(chǔ)上，F(xiàn)orskolin增加了胰島素分泌（8.3 G,n=6vs8.3G+Forsk

5、olin，10μM，n=6，P<0.05）；(4)在有SQ2253610μ的作用下，可以阻斷Forskolin增加胰島素分泌的作用(8.3G+Forskolinvs8.3G+SQ22536+Forskolin，10μM，n=6，P<0.05)。(5)在 cAMP量檢測(cè)試驗(yàn)中，所測(cè) cAMP值分別為2.8G組999.68±95.82fmol/10islets/hr，8.3G組1021.77±73.73fmol/10islets/hr,8.

6、3G+SQ22536組1187.23±133.13fmol10islets/hr，8.3G+Forskolin組3682.14±395.38fmol/10islets/hr，8.3G+SQ22536+Forskolin組2947.21±157.63 fmol/10islets/hr。Forskolin增加了胰島β細(xì)胞內(nèi)生物合成的cAMP(8.3G n=6 vs8.3G+Forskolin，10μM，n=6，P<0.01)；同時(shí)cAMP的

7、量沒(méi)有影響(8.3Gvs8.3G+SQ22536,10μM, n=6, P＞0.05)；但是SQ22536可以部分阻斷Forskolin增加了胰島β細(xì)胞內(nèi)生物合成的cAMP的量(8.3G+Forskolin,10μM, n=6vs8.3G+SQ22536+Forskolin,10μM, n=6, P<0.05)。(6)通過(guò)膜片鉗實(shí)驗(yàn)看出，KV通道的開(kāi)放可被Forskolin極大地抑制，減小KV電流，同樣的情況下SQ22536對(duì)KV電流沒(méi)

8、有影響，而給予Forskolin+SQ22536加藥刺激，則可以發(fā)現(xiàn)SQ22536部分阻斷Forskolin抑制 KV通道開(kāi)放的作用。在80mV的刺激時(shí)，記錄電流密度為Forskolin(n=6,76.67±2.78pA/pF)，SQ22536+Forskolin(n=6,109.89±4.58pA/pF)與對(duì)照組(n=6,139.62±4.54pA/pF)相比明顯地抑制 KV電流；Forskolin(n=6,76.67±2.78pA/

9、p)與SQ2253+Forskolin(n=6,109.89±4.58pA/pF)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而SQ22536(n=6,132.43±2.78pA/pF)對(duì)KV的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在二甲基亞砜DMSO加藥組與對(duì)照組的比較中，尚未發(fā)現(xiàn)DMSO對(duì)KV通道有影響。(7)使用膜片鉗檢測(cè)動(dòng)作電位時(shí)程(APD)，F(xiàn)orskolin加藥組(70.28±5.18ms,10μM，n=8)相比較對(duì)照組(40.61±3.77ms, n=8)，p<0.0

10、1；Forskolin+SQ22536加藥組(52.73±2.19,10μM，n=8)與Forskolin加藥組比較，可以減少Forskolin對(duì)動(dòng)作電位的延長(zhǎng)，p<0.05。(8)在離子成像試驗(yàn)中得到，在低葡萄糖濃度，尚未發(fā)現(xiàn)Forskolin(10μM, n=8)可以使細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度有變化。在高糖的基礎(chǔ)上，給予 Forskolin(10μM, n=8)的刺激，發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度的變化有顯著影響；同樣條件，先給予SQ2253

11、6(SQ,10μM，n=8)的加藥刺激，未見(jiàn)明顯變化，持續(xù)一段時(shí)間以后，接著給細(xì)胞 Forskolin(FSK,10μM, n=8)的刺激。
　　結(jié)論：
　　(1)梯度分離法分離純化胰島，消化得到的胰島β細(xì)胞狀態(tài)良好。(2)實(shí)驗(yàn)中分得的胰島DTZ染色顯示純度高，AO/PI染色說(shuō)明活性良好。(3)在正常生理狀態(tài)下，胰島功能好。Forskolin有促胰島素分泌作用，可被SQ22536所減弱，而SQ22536對(duì)胰島素分泌沒(méi)有影響，

12、說(shuō)明胰島素分泌量被cAMP所增加。(4)加入藥物Forskolin能使細(xì)胞內(nèi)的cAMP含量明顯升高，且Forskolin升高cAMP的作用可以被SQ22536削減。(5) Forskolin明顯抑制KV通道，而這種作用可被SQ22536所消除，說(shuō)明cAMP會(huì)影響KV通道的開(kāi)放和閉合。(6) Forskolin顯著延長(zhǎng)ADP，SQ22536可以縮短Forskolin對(duì)AP時(shí)程的延長(zhǎng)，說(shuō)明增加細(xì)胞內(nèi)cAMP的量可以延長(zhǎng)APD。(7)胰島細(xì)胞

13、內(nèi)的鈣離子濃度在加入Forskolin后明顯增加了， SQ22536能夠消弱Forskolin升高鈣離子濃度的作用。綜上所述，在胰島β細(xì)胞上通過(guò)使用AC激動(dòng)劑Forskolin增加細(xì)胞內(nèi)在cAMP的生物合成，cAMP可以抑制KV通道的開(kāi)放，使APD作用延長(zhǎng)，使鈣離子進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的時(shí)間延長(zhǎng)，使細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度顯著增多，最終使胰島素的分泌的量增加；在加入藥物 SQ22536，尚未發(fā)現(xiàn)該藥其本身對(duì)胰島素分泌及KV電流有影響，但該藥可以阻斷F