乙肝病毒X基因?qū)φＨ烁渭?xì)胞株HL-7702線(xiàn)粒體功能的影響及可能機(jī)制的探討.pdf

1、目的：利用RNA干擾技術(shù)研究乙型肝炎病毒(HBV)X基因及其產(chǎn)物X蛋白(HBx)對(duì)正常人肝細(xì)胞株HL-7702線(xiàn)粒體功能的影響，并探討其可能機(jī)制。 方法：利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建并鑒定靶向HBx的小干擾RNA(siRNA)重組表達(dá)質(zhì)粒pX1和pX2，并以不針對(duì)任何序列的重組質(zhì)粒pScr作為對(duì)照，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染入穩(wěn)定表達(dá)HBx基因的正常人肝細(xì)胞株HL-7702/HBx，應(yīng)用RT-PCR及Westem印跡分別從mRNA、蛋白水平檢測(cè)

2、其對(duì)HBx阻抑效應(yīng)，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)和線(xiàn)粒體膜電位( AΨm)水平的變化。Westem印跡分別檢測(cè)HL-7702/HBx組、轉(zhuǎn)染pX1組、轉(zhuǎn)染pScr組以及加入抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)組細(xì)胞氧化應(yīng)激信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白Bax、Bc1-2、細(xì)胞色素C(cyt C)、caspase-9和caspase-3的表達(dá)。 結(jié)果：酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果證實(shí)了pX1和pX2的成功構(gòu)建。pX1、pX2分別轉(zhuǎn)染入HL-

3、7702/HBx細(xì)胞48h后，與空白對(duì)照組比較，pX1和pX2兩組HBx mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，但pX1組抑制效果強(qiáng)于pX2組(P<0.05)。流式細(xì)胞儀分析顯示經(jīng)過(guò)RNAi后細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯降低，ΔΨm水平明顯升高，與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Westem印跡檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染pX1的RNAi組和抗氧化劑NAC組與HL-7702/HBx組相比，線(xiàn)粒體Bax蛋白表達(dá)下調(diào)，Bc1-2蛋白表