乙肝病毒X基因?qū)φＨ烁渭毎闔L-7702線粒體功能的影響及可能機制的探討.pdf

1、目的：利用RNA干擾技術研究乙型肝炎病毒(HBV)X基因及其產(chǎn)物X蛋白(HBx)對正常人肝細胞株HL-7702線粒體功能的影響，并探討其可能機制。 方法：利用分子克隆技術構(gòu)建并鑒定靶向HBx的小干擾RNA(siRNA)重組表達質(zhì)粒pX1和pX2，并以不針對任何序列的重組質(zhì)粒pScr作為對照，通過脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染入穩(wěn)定表達HBx基因的正常人肝細胞株HL-7702/HBx，應用RT-PCR及Westem印跡分別從mRNA、蛋白水平檢測

2、其對HBx阻抑效應，并用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)和線粒體膜電位( AΨm)水平的變化。Westem印跡分別檢測HL-7702/HBx組、轉(zhuǎn)染pX1組、轉(zhuǎn)染pScr組以及加入抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)組細胞氧化應激信號傳導通路相關蛋白Bax、Bc1-2、細胞色素C(cyt C)、caspase-9和caspase-3的表達。 結(jié)果：酶切鑒定和測序結(jié)果證實了pX1和pX2的成功構(gòu)建。pX1、pX2分別轉(zhuǎn)染入HL-

3、7702/HBx細胞48h后，與空白對照組比較，pX1和pX2兩組HBx mRNA和蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)，但pX1組抑制效果強于pX2組(P<0.05)。流式細胞儀分析顯示經(jīng)過RNAi后細胞內(nèi)ROS水平明顯降低，ΔΨm水平明顯升高，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Westem印跡檢測顯示，轉(zhuǎn)染pX1的RNAi組和抗氧化劑NAC組與HL-7702/HBx組相比，線粒體Bax蛋白表達下調(diào)，Bc1-2蛋白表