NK細(xì)胞調(diào)控LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)以腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥為模型，通過抗體清除外周及腦內(nèi)浸潤(rùn)的自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cells，NK)，檢測(cè)NK細(xì)胞在神經(jīng)炎癥中對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響，以探討NK細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中的作用。
　　方法：
　　1、動(dòng)態(tài)觀察和監(jiān)測(cè)LPS處理不同時(shí)間點(diǎn)小鼠體重，繪制體重變化曲線以確定系

2、統(tǒng)性炎癥的變化。于LPS或PBS處理兩次時(shí)同時(shí)尾靜脈注射4％ Evans Blue200ul，次日用1％戊巴比妥鈉100ul麻醉小鼠，待其深入麻醉時(shí)用冰PBS心臟灌注，取腦觀察Evans Blue是否浸潤(rùn)腦組織。正常情況下由于血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)的存在，Evans Blue不能進(jìn)入腦組織，若BBB的完整性遭到損傷或者BBB通透性增加時(shí)，Evans Blue會(huì)經(jīng)外周血液循環(huán)浸潤(rùn)到腦內(nèi)。以此來探討LPS

3、誘導(dǎo)的系統(tǒng)性炎癥能否夠引起B(yǎng)BB的破壞。
　　2、免疫熒光抗體標(biāo)記腦單細(xì)胞后，流式分析NK細(xì)胞及其他炎癥細(xì)胞向CNS的浸潤(rùn)，同時(shí)用免疫熒光檢測(cè)腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)，以此來探討LPS能否引起CNS的炎癥反應(yīng)。
　　3、用抗NK抗體(PK136)清除外周NK細(xì)胞，清除NK細(xì)胞后用LPS處理三次，LPS20微克/只/天（以下稱為L(zhǎng)PS+PK136組），并于每次LPS處理時(shí)檢測(cè)小鼠體重。用流式分析CNS中浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的變化，同

4、時(shí)免疫熒光檢測(cè)PBS組、LPS組和LPS+PK136組腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞Iba1的表達(dá)情況和腦組織炎性因子mRNA的表達(dá)水平。
　　4、為了解NK細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中的細(xì)胞學(xué)機(jī)制，動(dòng)態(tài)檢測(cè)LPS處理不同時(shí)間點(diǎn)NK細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞向CNS的浸潤(rùn)，用抗NK抗體預(yù)先清除外周NK細(xì)胞后進(jìn)而LPS處理，流式檢測(cè)浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的變化。
　　結(jié)果：
　　1、LPS處理后小鼠體重逐步減輕，于第二、三天降至最低，

5、隨后又呈上升趨勢(shì)，故本實(shí)驗(yàn)采用LPS處理二天或三天炎癥較重時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)4％ Evans Blue處理后發(fā)現(xiàn)LPS組的腦組織被染料著色，而PBS組腦組織基本上沒有顏色變化，說明BBB的完整性遭到破壞。此實(shí)驗(yàn)證明LPS誘導(dǎo)系統(tǒng)性炎癥的同時(shí)也引起了BBB通透性的增加，提示外周的免疫細(xì)胞可能會(huì)浸潤(rùn)到CNS中。
　　2、在腦組織流式分析中發(fā)現(xiàn)LPS處理后CNS中有大量白細(xì)胞浸潤(rùn)，包括NK細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞顯著增加，提示此時(shí)CNS內(nèi)

6、發(fā)生了炎癥反應(yīng)。腦組織免疫熒光Iba1染色發(fā)現(xiàn)LPS組較PBS組小膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化。此外，腦組織mRNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LPS組比PBS組IL-1表達(dá)水平顯著性增加。此實(shí)驗(yàn)說明腹腔注射LPS誘導(dǎo)系統(tǒng)性炎癥的同時(shí)也引起了神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥。
　　3、預(yù)先清除NK細(xì)胞后進(jìn)而LPS腹腔注射，發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞較未清除NK組顯著性降低，小膠質(zhì)細(xì)胞活化明顯減輕，體重顯著性增加，IL-1表達(dá)也顯著性降低。此實(shí)驗(yàn)提示NK細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中

7、可能起促炎作用。
　　4、在LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥模型中，CNS中NK細(xì)胞的浸潤(rùn)早于中性粒細(xì)胞。預(yù)先清除NK細(xì)胞后CNS中浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞顯著性降低。此實(shí)驗(yàn)說明在LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎性模型中，浸潤(rùn)的NK細(xì)胞可能通過吸引外周中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)CNS的炎癥反應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　腹腔注射LPS引起全身系統(tǒng)性炎癥的同時(shí)也可以誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生炎癥，伴隨大量免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，清除其中的NK細(xì)胞導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥減輕