基于家系和單體型的TIM-1及TIM-3基因多態(tài)性與變應(yīng)性哮喘的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、變應(yīng)性哮喘是一種與免疫相關(guān)的復(fù)雜疾病，受遺傳和環(huán)境等多種因素的共同影響而發(fā)病。個體的遺傳因素在哮喘發(fā)病中起著十分重要的作用。應(yīng)用全基因組掃描或定位克隆技術(shù)已發(fā)現(xiàn)多個染色體區(qū)域與哮喘連鎖。其中以5q31-33 區(qū)最受研究者的關(guān)注，因為該區(qū)域包含眾多細(xì)胞因子的基因以及一些與免疫相關(guān)的基因，且在多個人群的關(guān)聯(lián)研究中重復(fù)表現(xiàn)與哮喘高度的連鎖。越來越多的研究表明TH1/TH2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的失衡與哮喘的發(fā)病相關(guān)。最近研究顯示表達(dá)在T細(xì)胞表

2、面的Tims基因家族蛋白在調(diào)節(jié)TH1和TH2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中起重要的作用。在人類，Tim-1和Tim-3是Tims基因家族重要的兩個成員，它們均位于與哮喘高度連鎖的染色體5q31-33區(qū)域。Tim-1主要表達(dá)在TH2細(xì)胞表面，調(diào)節(jié)TH2細(xì)胞的免疫應(yīng)答。而Tim-3主要表達(dá)在TH1細(xì)胞表面，對TH1細(xì)胞起負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用?；赥im-1和Tim-3在TH1/TH2免疫調(diào)節(jié)中重要的功能，Tim-1和Tim-3基因已成為哮喘重要的易感候選

3、基因。針對Tim-1和Tim-3多態(tài)性與哮喘的關(guān)聯(lián)研究雖已在多個人群中開展，但受多種因素的影響，這些研究的結(jié)果未能得到統(tǒng)一和重復(fù)。對Tim-1與Tim-3基因多態(tài)性與哮喘的關(guān)系，仍需進一步研究。本研究我們首先探討了Tim-1與Tim-3基因的表達(dá)與變應(yīng)性哮喘的關(guān)系，然后采用基于家系和單體型的關(guān)聯(lián)研究方法，應(yīng)用TDT和HRR檢驗來分析Tim-1和Tim-3基因的多態(tài)性及單體型與中國湖北地區(qū)變應(yīng)性哮喘及相關(guān)表型的相關(guān)性。研究分為3個部分。<

4、br>　　 第一部分：Tim-1及Tim-3在變應(yīng)性哮喘患者PBMC中的表達(dá)
　　 目的：探討Tim-1和Tim-3mRNA 在變應(yīng)性哮喘患者外周血單個核細(xì)胞的表達(dá)水平，為進一步闡明Tims基因與哮喘的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：隨機收集的塵螨過敏性哮喘患者，共計12例，哮喘診斷全部符合2003年中華醫(yī)學(xué)會呼吸學(xué)分會哮喘學(xué)組制定的標(biāo)準(zhǔn)。同時選取性別和年齡匹配的健康體檢者12例作為對照。實驗分3組，分別為哮喘組，塵螨刺激

5、組和正常對照組。Ficoll 分離PBMC后，取24孔培養(yǎng)板，哮喘組和塵螨刺激組每孔分別加入106個病人分離的PBMC，正常對照組加入106個健康體檢者的PBMC，對塵螨刺激組再加入終濃度為20 μg/m1的塵螨抗原。然后置37 ℃ 5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞，抽提總RNA。參照文獻(xiàn)Tim-1、Tim-3引物序列，合成引物，采用實時熒光定量RT-PCR檢測3組Tim-1和Tim-3的mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：

6、1. Tim-1 mRNA 在塵螨過敏性哮喘患者外周血PBMC中相對表達(dá)值為0.27±0.09，顯著高于健康對照組的0.13±0.03（P<0.05）；患者PBMC 在終濃度為20μg/m1的塵螨抗原刺激后，Tim-1表達(dá)明顯升高，達(dá)0.59±0.22，與對照組和未刺激的哮喘組相比有顯著差異（P<0.01）；2. Tim-3mRNA 在哮喘患者外周血PBMC中相對表達(dá)值為0.39±0.09，明顯高于健康對照組的0.18±0.06，差異有

7、顯著性（P<0.05），同樣患者PBMC 在塵螨抗原刺激后，Tim-3 mRNA的表達(dá)也出現(xiàn)明顯的升高，達(dá)0.66±0.22，與對照組和未刺激組相比差異均有顯著性（P<0.01）。
　　 結(jié)論：Tim-1和Tim-3mRNA 在塵螨變應(yīng)性哮喘患者中表達(dá)明顯升高，Tim-1和Tim-3可能參與人類變應(yīng)性哮喘的發(fā)生和發(fā)展。
　　 第二部分：Tim-3基因多態(tài)性及其與變應(yīng)性哮喘易感性的關(guān)系
　　 第一節(jié)：Tim-3基因

8、序列的測定及其多態(tài)性的確定
　　 目的：探討湖北地區(qū)漢族人群Tim-3基因啟動子區(qū)和編碼區(qū)的多態(tài)性及其構(gòu)成的單體型特征，為后續(xù)基于Tim-3基因多態(tài)性與相關(guān)疾病的關(guān)聯(lián)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：選取湖北地區(qū)30例正常漢族人和30例變應(yīng)性哮喘患者作為研究對象。采用分段PCR 擴增直接測序法檢測這60名研究對象Tim-3基因的啟動子區(qū)、全部的外顯子區(qū)及部分內(nèi)含子區(qū)的多態(tài)性變異。將測序結(jié)果與NCBI 及HapMap數(shù)據(jù)庫進行對

9、比，確定湖北漢族人群Tim-3基因多態(tài)性的分布特征。采用Pearson χ2檢驗或Fisher's 確切概率法比較各位點的基因型和等位基因的頻率在哮喘組和正常人組的分布。采用Haploview軟件對各位點進行LD 分析、單體型的構(gòu)建和tSNPs的篩選。
　　 結(jié)果：1. Tim-3基因區(qū)域共檢出13個多態(tài)位點，其中有5個為新發(fā)現(xiàn)的位點。各位點基因型和等位基因頻率在30例正常組和30例哮喘組中未見明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

10、2. 經(jīng)與HapMap數(shù)據(jù)庫比較，4個位點rs4704853、rs10515746、rs4704846、rs9313439等位基因的頻率在湖北漢族人和北方漢族及日本人中的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而與歐洲人及非洲人的分布有明顯的不同（P<0.01）。3.對7個頻率大于5%的SNPs 進行兩兩配對的LD 分析顯示其中6個位點之間呈現(xiàn)較強的連鎖不平衡（D′和r2 均大于0.3）。單體型分析共發(fā)現(xiàn)有5種頻率大于1%的常見單體型。4

11、. 在該單體型域中選出3個tSNPs：rs10053538、rs13170556和rs9313441 用來代表該區(qū)域常見多態(tài)性變異。
　　 結(jié)論：湖北漢族人群Tim-3基因的SNPs分布有別于其他人種，基于這些SNPs 構(gòu)建的單體型和篩選出的tSNPs為研究湖北漢族人群Tim-3基因多態(tài)性與相關(guān)疾病的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二節(jié)：基于家系的Tim-3基因多態(tài)性與變應(yīng)性哮喘的關(guān)聯(lián)研究
　　 目的：探討Tim-3基

12、因的多態(tài)性及其單體型與湖北地區(qū)漢族人群變應(yīng)性哮喘及相關(guān)表型的關(guān)系。
　　 方法：收集湖北地區(qū)118個完整的由一名患者及其雙親組成的變應(yīng)性哮喘核心家系，共354名成員，均為漢族。應(yīng)用PCR-RFLP方法，對118個核心家系Tim-3基因3個標(biāo)簽SNPs，rs10053538、rs13170556和rs9313441及1個啟動子區(qū)的多態(tài)性rs10515746 進行基因分型；采用基于單體型-標(biāo)簽SNP和家系資料的關(guān)聯(lián)檢驗的方法（TDT

13、，HRR，F(xiàn)BAT），分析Tim-3基因的多態(tài)性及其單體型與湖北地區(qū)漢族人群變應(yīng)性哮喘及相關(guān)表型的關(guān)系。
　　 結(jié)果：1. Tim-3基因的4個SNPs單個位點TDT和HRR 分析結(jié)果顯示，Tim-3基因的這4個多態(tài)性與湖北漢族人變應(yīng)性哮喘之間不存在連鎖不平衡關(guān)系，P＞0.05。2. 應(yīng)用TRANSMIT軟件進行單體型的TDT 分析結(jié)果顯示，Tim-3基因的單體型與變應(yīng)性哮喘有關(guān)聯(lián)，Global χ2檢驗，χ2=10.83，P=

14、0.013。單個單體型TDT結(jié)果顯示，父母傳遞給患病子女G-G-G單體型的觀察值小于期望值，差異有顯著性（χ2=8.24，P=0.004）。單體型HRR 分析顯示G-G-G，具有較低的發(fā)病風(fēng)險(HRR=0.49)。3. FBAT分析結(jié)果顯示Tim-3基因的多態(tài)性及單體性與哮喘數(shù)量表型血清總IgE 水平無關(guān)聯(lián)。
　　 結(jié)論：Tim-3基因區(qū)域的多態(tài)性以單體型的形式影響哮喘的易感性，Tim-3基因本身或其附近的染色體區(qū)域內(nèi)可能存在與

15、變應(yīng)性哮喘易感性相關(guān)的位點。單體型G-G-G可能作為用來對湖北漢族人群哮喘易感性進行預(yù)測為標(biāo)志。
　　 第三部分:基于家系的Tim-1基因多態(tài)性與變應(yīng)性哮喘易感性關(guān)系
　　 目的：探討Tim-1基因的多態(tài)性及其單體型與湖北地區(qū)漢族人群變應(yīng)性哮喘及哮喘相關(guān)表型的關(guān)系。
　　 方法：收集湖北地區(qū)118個完整的由一名患者及其雙親組成的變應(yīng)性哮喘核心家系，共354名成員，均為漢族。應(yīng)用PCR —RFLP方法，對118個核

16、心家系Tim-1基因3個標(biāo)簽SNPs（rs4704842、rs953569、rs2134230）和1個位于啟動子區(qū)的多態(tài)位點-232 G>A以及1個位于外顯子4區(qū)多態(tài)位點 rs45623443 進行基因分型；采用基于單體型-標(biāo)簽SNPs和家系資料的關(guān)聯(lián)檢驗的方法（TDT，HRR;，F(xiàn)BAT），檢測Tim-1基因的多態(tài)性及其單體型與湖北地區(qū)漢族人群變應(yīng)性哮喘及哮喘相關(guān)表型的關(guān)系。
　　 結(jié)果：1. Tim-1基因的5個SNPs單個

17、位點TDT和HRR 分析結(jié)果顯示均與哮喘無關(guān)聯(lián)，P>0.05。2.單體型的TDT和HRR 分析發(fā)現(xiàn)Tim-1基因區(qū)域的G-A-ins-C-G單體型與變應(yīng)性哮喘有關(guān)聯(lián)，P<0.05。該單體型由父母傳遞給患病子女的觀察值高于期望值，是變應(yīng)性哮喘發(fā)病的一個風(fēng)險因素，HRR=1.91。3. FBAT分析結(jié)果顯示Tim-1基因rs45623443 多態(tài)性位點Ins等位基因與哮喘表型血清總IgE 水平相關(guān)，P<0.05；4. Tim-1單體型的FB