TIM4基因多態(tài)性與變應(yīng)性哮喘關(guān)系的病例對照及家系研究.pdf

1、支氣管哮喘是臨床上一種以反復(fù)發(fā)作的喘息、胸悶、呼吸困難和咳嗽等為特征的氣道慢性炎癥性疾病。其發(fā)病率在大部分國家呈逐年上升的趨勢。哮喘的發(fā)病受遺傳因素和環(huán)境因素的共同影響。多個研究顯示人類染色體5q31～33區(qū)域與哮喘相關(guān)，該區(qū)域受到國際上的廣泛關(guān)注。Th1/Th2細(xì)胞的失衡被認(rèn)為在哮喘的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用。TIM基因家族是一個影響Th細(xì)胞分化發(fā)育的基因家族—T細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白域蛋白基因家族。人類的TIM家族位于染色體5q33.2

2、，包括3個成員TIM1,TIM3和TIM4。TIM1表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面，在Th2細(xì)胞明顯多于Th1細(xì)胞。TIM3特異性表達(dá)于終末期Th1細(xì)胞表面，其與受體結(jié)合后下調(diào)Th1細(xì)胞的免疫應(yīng)答。TIM4主要表達(dá)于成熟的樹突狀細(xì)胞，巨噬細(xì)胞的膜表面，TIM4與其受體TIM1的結(jié)合后，促進Th2細(xì)胞的分化與增殖。最近的研究顯示增強TIM4的表達(dá)會促進Th2細(xì)胞的優(yōu)勢分化，并導(dǎo)致一些過敏性反應(yīng)的發(fā)生。因此，TIM4也是哮喘的候選研究基因。已有多篇

3、文獻(xiàn)報道了TIM1,TIM3基因多態(tài)性與哮喘的相關(guān)關(guān)系，但在不同的人種中結(jié)果不一。Natalie S報道了TIM4的一個主要的單體型在高加索人群中與過敏性鼻炎相關(guān)。但TIM4基因多態(tài)性與哮喘之間的關(guān)系尚不清楚，有待進一步的研究。
　　 本課題以“中國漢族哮喘人群TIM4基因多態(tài)性的確定，TIM4基因多態(tài)性與哮喘的關(guān)聯(lián)研究，TIM4基因變異的功能學(xué)探討”為研究主線，對TIM4基因多態(tài)性與哮喘的關(guān)系進行了探討。本研究共分為以下三部分

4、：
　　 第一部分：中國漢族哮喘人群TIM4基因啟動子及外顯子區(qū)的測序研究
　　 目的：研究中國漢族哮喘患者T細(xì)胞免疫球蛋白域粘蛋白域蛋白4(T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein 4，TIM4)啟動子區(qū)，外顯子區(qū)，3’非翻譯區(qū)的基因多態(tài)性的分布特征及啟動子區(qū)單體型頻率分布。
　　 方法：采用直接測序法對TIM4啟動子區(qū)，外顯子區(qū)，3’非翻譯區(qū)進

5、行了研究，JLIN軟件分析啟動子區(qū)各位點間的連鎖不平衡關(guān)系。
　　 結(jié)果：我們在中國漢族哮喘患者的TIM4基因共檢測到了6個SNP，分別分布于啟動子區(qū)和外顯子2，外顯子9。其中TIM4-1609G>A，-153 T>C，43746C>T為新發(fā)現(xiàn)的3個SNP位點，最小等位基因頻率分別為0.10，0.15，0.05。Rs6874202位點的A等位基因頻率在中國漢族哮喘人群高于中國漢族人群（P<0.05）。Rs6874202位點和rs

6、6882076位點的等位基因頻率在不同人種之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。啟動子區(qū)的4個SNPs的等位基因呈現(xiàn)連鎖不平衡關(guān)系。在構(gòu)成的單體型中，最常見的單體型GGTG的頻率為0.630。
　　 結(jié)論：中國漢族TIM4的SNP分布特征與其他人種存在差異。Rs6874202位點與哮喘之間可能存在關(guān)聯(lián)。中國漢族哮喘患者TIM4啟動子區(qū)的4個SNP連鎖，存在連鎖不平衡關(guān)系。
　　 第二部分：TIM4基因多態(tài)性與哮喘及其表型的關(guān)聯(lián)研究

7、>　　 目的：研究TIM4基因10個SNPs及組成的單體型與哮喘和其表型的相關(guān)性。
　　 方法：采用錯配引物PCR限制性內(nèi)切酶片段多態(tài)性的方法對208名哮喘兒童和232名健康對照的rs6874202和rs6882076的多態(tài)性進行了檢測，比較了等位基因和基因型頻率在病例組與對照組之間的差異。采用化學(xué)發(fā)光法測定了血漿總IgE的含量，并分析了rs6874202和rs6882076與血漿總IgE之間的相關(guān)性。采用錯配引物PCR限制性

8、內(nèi)切酶多態(tài)性的方法對118個核心家庭的TIM4 new1，rs6874202，TIM4 new2，rs6882076，8579G>A，rs7724832，rs7700944，rs1345617，rs1345618和TIM4 new3的多態(tài)性進行了檢測，采用TDT檢驗分析了它們與哮喘及血漿總IgE之間的相關(guān)性。用Haploview軟件分析了這些SNP之間的連鎖不平衡關(guān)系，確定了TIM4的單體型域。用Transmit軟件進一步分析了單體型與

9、哮喘之間的關(guān)聯(lián)性。
　　 結(jié)果：rs6874202等位基因及基因型頻率在哮喘組與健康對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），A等位基因頻率在哮喘組高于正常對照組。家系標(biāo)本中傳遞A等位基因的數(shù)量明顯高于未傳遞數(shù)，也顯示rs6874202與哮喘易感性具有關(guān)聯(lián)。其他分型的SNP位點則與哮喘易感性不相關(guān)。所檢測的SNP多態(tài)性位點均與血漿總IgE無相關(guān)性。中國漢族的TIM4基因可分為兩個Block，Block1中的單體型GGTGGG的頻

10、率最高，占64.7%，GACAGG單體型與哮喘易感性呈正相關(guān)，GGTAGG單體型與哮喘易感性呈負(fù)相關(guān)。而Block2的的3種常見單體型與哮喘易感性均不相關(guān)。
　　 結(jié)論：rs6874202與哮喘存在關(guān)聯(lián)性，A等位基因的攜帶者患哮喘的風(fēng)險是G等位基因攜帶者的1.91倍。單體型GACAGG與哮喘之間呈正相關(guān)，可能增加哮喘的罹患危險。
　　 第三部分：TIM4啟動子活性的熒光素酶報告基因研究
　　 目的：構(gòu)建兩種含TI

11、M4基因啟動子的熒光素酶報告基因載體，研究不同的TIM4基因啟動子序列對熒光素酶在16HBE細(xì)胞中表達(dá)的影響，評價SNPrs6874202對TIM4基因啟動子活性的調(diào)控。
　　 方法：采用重疊PCR構(gòu)建GACA和GGCA單體型PCR產(chǎn)物，定向克隆到含熒光素酶報告基因的載體pGL3-Basic中。將含不同單體型的TIM4基因啟動子的報告載體pGL3-GACA，pGL3-GGCA,及空載體pGL3-Basic瞬時轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞，

12、以pRL-TK為內(nèi)參照，48小時后檢測熒光素酶的相對活性。
　　 結(jié)果：經(jīng)過酶切鑒定和測序鑒定，證明成功構(gòu)建了兩種含TIM4基因啟動子的熒光素酶報告基因載體pGL3-GACA，pGL3-GGCA，僅在一處存在堿基差異。兩種報告載體都能在16HBE細(xì)胞表達(dá)，熒光素酶相對活性明顯高于空載體pGL3-Basic。GACA單體型的報告載體的熒光素酶相對活性與GGCA單體型的報告載體存在差異（P<0.05），前者是后者的1.45倍。