抗哮喘藥物基因多態(tài)性與哮喘兒童臨床特征及療效的相關(guān)性研究.pdf

1、本文對抗哮喘藥物基因多態(tài)性與哮喘兒童臨床特征及療效的相關(guān)性進(jìn)行了研究。本研究分為三個部分：
　　第一部分：中國浙南地區(qū)哮喘兒童及非哮喘兒童抗哮喘藥物基因多態(tài)性檢測。
　　目的：⑴了解中國浙南地區(qū)哮喘兒童及非哮喘兒童中β2受體激動劑、糖皮質(zhì)激素、白三烯通路及相關(guān)藥物代謝酶的基因多態(tài)性分布情況；⑵比較β2受體激動劑、糖皮質(zhì)激素、白三烯通路及相關(guān)藥物代謝酶的基因多態(tài)性在不同種族人群中的分布情況。
　　方法：①2015年8月~

2、2016年4月至我院兒童呼吸科門診就診的＜18歲哮喘患者412例作為哮喘組；同期至我院兒童保健科門診體檢的＜18歲正常者262例作為對照組。使用統(tǒng)一的支氣管哮喘問卷調(diào)查表，由患兒監(jiān)護(hù)人填寫，建立臨床資料數(shù)據(jù)庫。②該研究已通過溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會審查。藥物基因組學(xué)研究和臨床研究目的均已充分告知參與者并簽署知情同意書。③手動搜索互聯(lián)網(wǎng)上（http://www.genecards.org、https://www.pharmgkb

3、.org/）的人類基因組數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)，查找符合條件的單核苷酸多態(tài)性（ Single nucleotide polymorphism, SNPs）。選擇標(biāo)準(zhǔn)（符合下列所有條件）：目前已發(fā)現(xiàn)與抗哮喘治療的主要三類藥物（β2受體激動劑、糖皮質(zhì)激素及白三烯調(diào)節(jié)劑）療效有關(guān)的SNPs；等位基因頻率在亞洲人群中≥1％。最終獲得55個SNPs，涉及17條染色體上38個基因，位點(diǎn)信息從www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/、www.ha

4、pmap.org獲得。④采集1管外周靜脈血2ml，采用Qiagen公司的全血DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，將DNA產(chǎn)物保存于-80℃冰箱備用。⑤采用MALDI-TOF質(zhì)譜法對674例標(biāo)本（哮喘組412例和對照組262例）進(jìn)行基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因分型。通過TYPER4.0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到分型數(shù)據(jù)。不同基因型隨機(jī)選取5%的樣本進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證。⑥用R軟件分析同一染色體上的單倍型（Haplotype, Ht），剔除單倍型組合頻

5、率＜0.03者。基因多態(tài)性位點(diǎn)的哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium, HWE）采用Haploview軟件（http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/）計(jì)算。P＞0.001則認(rèn)為符合HWE平衡。哮喘組和對照組的最小等位基因頻率（Minor allele frequency, MAF）用SHEsis在線軟（http://analysis.bio-x.cn/myAnaly

6、sis.php）獲得。不同人群的MAF通過http://browser.1000genomes.org獲得。⑦應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用卡方檢驗(yàn)和Fisher確切概率法比較等位基因、基因型及單倍型頻率在哮喘組與對照組兒童中、本研究人群與不同種族人群中的分布情況。雙側(cè)P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：⑴研究共納入674例兒童，其中哮喘組412例，對照組262例，年齡為7（5~9）歲，其中男性430例（占63.8%

7、）。哮喘組和對照組的年齡、性別組間有可比性（P值分別為0.059和0.312）。⑵ORMDL3 rs2872507 AA基因型和ZNF432 rs3752120 TT基因型頻率在哮喘組顯著高于對照組（0.054 vs.0.042, P=0.002;0.153 vs.0.123, P=0.045）。哮喘組的ADAM33 rs2280091等位基因G和ORMDL3 rs2872507等位基因A頻率顯著高于對照組（0.081 vs.0.052

8、, P=0.040;0.273 vs.0.217, P=0.018）。⑶本研究人群中多數(shù)SNPs的MAF與非洲人群（AFR）及歐美人群（AMR、EUR）的MAF比較有顯著性差異（P＜0.05），與亞洲人群（CHB、JPT）的MAF無顯著性差異（P＞0.05），尤其是與本國人群CHB的MAF檢測結(jié)果基本相似（P＞0.05），除了rs2115819、rs2243250、rs2872507的MAF與千人基因組計(jì)劃中的CHB呈差異分布。其中rs

9、2115819和rs2243250的MAF顯著高于CHB（0.859 vs.0.718, P=0.000;0.812 vs.0.738, P=0.013），rs2872507的MAF顯著低于CHB（0.238 vs.0.364, P=0.000）。⑷五號染色體上的單倍型Ht8、Ht9和Ht10在哮喘組的頻率顯著高于對照組（P＜0.05）。十號染色體上的單倍型Ht9頻率在哮喘組顯著高于對照組（P＜0.05）。十一號染色體上的22個單倍型在

10、哮喘組和對照組中分布均有顯著性差異（P＜0.05）。十二號染色體上的單倍型Ht1、Ht5和Ht8在哮喘組的頻率顯著高于對照組（P＜0.05）。十七號染色體上單倍型Ht5在哮喘組的頻率顯著低于對照組（P＜0.05）。十九號染色體上單倍型Ht4在哮喘組的頻率顯著低于對照組（P＜0.05）。七號染色體、十三號染色體、十六號染色體上的單倍型組合在哮喘組和對照組中分布均無顯著性差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：①ORMDL3 rs28725

11、07 AA基因型和ZNF432 rs3752120 TT基因型是中國浙南地區(qū)哮喘兒童的易感基因型。ADAM33 rs2280091等位基因 G和 ORMDL3 rs2872507等位基因A是中國浙南地區(qū)哮喘兒童的易感等位基因。②中國浙南地區(qū)兒童中的抗哮喘藥物基因多態(tài)性分布頻率與歐美及非洲人群的分布差異較大，與中國北京漢族人群、日本東京人群分布相似。但有少數(shù)SNPs包括rs2115819、rs2243250和rs2872507在中國浙南地

12、區(qū)與北京漢族人群中的分布存在差異。③單倍型分析更適合多基因多位點(diǎn)參與的哮喘疾病遺傳機(jī)制研究。
　　第二部分：抗哮喘藥物基因多態(tài)性與哮喘兒童臨床特征的相關(guān)性。
　　目的：⑴比較哮喘不同分期的肺功能變化、過敏狀態(tài)及炎癥反應(yīng)情況；⑵明確β2受體激動劑、糖皮質(zhì)激素、白三烯通路及相關(guān)藥物代謝酶的基因多態(tài)性與兒童哮喘臨床特征之間的相關(guān)性；
　　方法：①選取5~14周歲且資料完整的哮喘兒童383例，及年齡相符合的正常兒童232例，共

13、615例，其中男394例（占64.1%），年齡7（6~9）歲。根據(jù)2016版兒童哮喘指南對哮喘組兒童進(jìn)行分期，其中急性發(fā)作期91例、慢性持續(xù)期131例和臨床緩解期161例。②完善哮喘兒童臨床資料的收集，包括哮喘病史、抗哮喘治療、特應(yīng)質(zhì)、父母哮喘史、煙暴露、家養(yǎng)寵物和居住環(huán)境等資料。③外周血TIgE采用化學(xué)發(fā)光法測定，外周血嗜酸性粒細(xì)胞比值采用全自動血液分析儀測定。血清LTC4濃度和骨膜蛋白濃度在第一部分血清中采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測。④選

14、取哮喘組和對照組中基因型呈差異分布的位點(diǎn) ORMDL3 rs2872507和ZNF432 rs3752120進(jìn)行基因分型。⑤肺功能測定前24小時內(nèi)沒有使用抗過敏藥物、抗白三烯藥物或長效β2受體激動劑，主要觀察指標(biāo)為第一秒鐘用力呼氣容積百分比（FEV1%）。⑥選取哮喘組和對照組中基因型呈差異分布的位點(diǎn)ORMDL3 rs2872507和ZNF432 rs3752120，分析不同基因型對哮喘臨床特征是否有影響。
　　結(jié)果：⑴過去1年吸入

15、型糖皮質(zhì)激素聯(lián)合長效β2受體激動劑單一制劑使用情況，急性發(fā)作期使用率顯著低于臨床緩解期哮喘兒童（95.6%vs.98.1%, P=0.000)。過去1年抗哮喘應(yīng)急藥物（包括CS和SABA）使用率情況，急性發(fā)作期95.6%，慢性持續(xù)期28.2%，臨床緩解期12.4%，各分期之間比較均有顯著性差異（P=0.000）。過去1年變應(yīng)原特異性免疫治療率，急性發(fā)作期或慢性持續(xù)期哮喘兒童均顯著低于臨床緩解期兒童（1.1%vs.12.4%, P=0.0

16、02;2.3%vs.12.4%, P=0.001）。⑵急性發(fā)作期哮喘兒童的肺功能FEV1%顯著低于慢性持續(xù)期和臨床緩解期哮喘兒童（P分別為0.021和0.003）。急性發(fā)作期和臨床緩解期哮喘患兒的外周血TIgE顯著高于慢性持續(xù)期（P分別為0.013和0.006）。急性發(fā)作期及慢性持續(xù)期哮喘患兒的EOS%均顯著低于臨床緩解期（P分別為0.001和0.013），慢性持續(xù)期和臨床緩解期患兒的EOS%均顯著高于對照組兒童（P均為0.000）。急

17、性發(fā)作期兒童的血清LTC4濃度顯著高于慢性持續(xù)期和臨床緩解期哮喘兒童（P分別為0.000和0.023）。哮喘組兒童的血清骨膜蛋白水平顯著高于對照組兒童（P=0.002），急性發(fā)作期兒童的血清骨膜蛋白水平顯著高于慢性持續(xù)期兒童（P=0.04）。⑶ZNF432 rs3752120 TT基因型攜帶者特應(yīng)質(zhì)比例顯著高于CC和CT基因型攜帶者（94.4%vs.71.7%, P=0.005;94.4%vs.77.9%, P=0.025）。rs287

18、2507各基因型之間的哮喘臨床特征比較均無顯著差異（P＞0.05）。⑷rs2872507和rs3752120不同基因型之間的基礎(chǔ)肺功能FEV1%、外周血TIgE、外周血EOS%、血清LTC4和骨膜蛋白比較均無顯著性差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：①吸入型糖皮質(zhì)激素聯(lián)合長效β2受體激動劑單一制劑和變應(yīng)原特異性免疫治療對哮喘均有良好的控制作用。血清LTC4和骨膜蛋白可作為哮喘的生物標(biāo)志物，有助于評估哮喘不同時期的炎癥反應(yīng)情況。②ZN

19、F432 rs3752120 TT基因型是中國浙南地區(qū)特應(yīng)質(zhì)哮喘兒童的易感基因型。rs2872507和rs3752120與本研究兒童哮喘特征無明顯相關(guān)性。
　　第三部分：抗哮喘藥物基因多態(tài)性對哮喘兒童接受吸入型布地奈德/福莫特羅治療的影響。
　　目的：⑴比較吸入型沙美特羅/氟替卡松與吸入型布地奈德/福莫特羅治療兒童哮喘的療效；⑵觀察β2受體激動劑、糖皮質(zhì)激素、白三烯通路及相關(guān)藥物代謝酶的基因多態(tài)性對哮喘兒童接受吸入型布地奈德

20、/福莫特羅治療反應(yīng)的影響；
　　方法：①隨訪觀察哮喘組兒童12周內(nèi)的抗哮喘藥物吸入裝置使用情況。選取第二部分哮喘組中接受吸入型沙美特羅/氟替卡松干粉劑50/100（舒利迭，F(xiàn)SC50/100）和吸入型布地奈德/福莫特羅干粉劑80/4.5（信必可，BFC80/4.5）治療的哮喘患者共160例，其中FSC50/100組為71例，BFC80/4.5組89例。對接受BFC80/4.5治療和FSC50/100治療的哮喘兒童進(jìn)行門診隨訪觀察1

21、2周，比較兩種藥物治療兒童哮喘的療效。比較不同SNPs對接受BFC80/4.5治療哮喘兒童的影響。②分別于抗哮喘吸入裝置治療前和治療12周后評估肺功能，方法同第二部分。4.抗哮喘治療反應(yīng)的評估指標(biāo)包括抗哮喘應(yīng)急藥物使用情況（包括CS和SABA）、呼吸道感染次數(shù)、住院率、FEV1%變化和有效率（（ΔFEV1%≥10%的人數(shù)）/總?cè)藬?shù)×100%）。
　　結(jié)果：⑴哮喘組兒童中抗哮喘吸入裝置使用率64.8%(248/383)，其中吸入型布

22、地奈德/福莫特羅干粉劑包括80/4.5和160/4.5使用率為37.1%（142/383），吸入型沙美特羅/氟替卡松干粉劑包括50/100和50/250使用率為18.8%（72/383）。⑵隨訪12周期間BFC80/4.5組和FSC50/100組哮喘兒童的抗哮喘應(yīng)急藥物使用率、呼吸道感染次數(shù)、住院率、FEV1%變化和有效率組間比較均無顯著性差異（P＞0.05），F(xiàn)SC50/100和BFC80/4.5治療的有效率分別為17.6%和23.1

23、%。⑶對接受BFC80/4.5治療的哮喘兒童進(jìn)行門診隨訪12周發(fā)現(xiàn)，8個SNPs包括rs1042713、rs2305089、rs2540487、rs2712807、rs28364072、rs320995、rs4980524、rs730012與抗哮喘治療反應(yīng)存在相關(guān)性。rs1042713 AA基因型攜帶者全身糖皮質(zhì)激素使用率顯著高于G等位基因攜帶者（AA=13.0%, GG=0.0%, GA=0.0%）（χ2=4.812, P=0.035

24、）。rs2305089 TT基因型攜帶者ΔFEV1%明顯下降（-9.10±4.18）， C等位基因攜帶者ΔFEV1%顯著改善（16.97±4.05）（χ2=10.556, P=0.005）。rs2540487 CC基因型攜帶者ΔFEV1%（7.01±4.03）顯著改善，T等位基因攜帶者治療后的ΔFEV1%明顯下降（-11.7667±8.57168）（χ2=5.350, P=0.021）。rs2712807 GG基因型攜帶者比GA基因型攜

25、帶者的呼吸道感染次數(shù)明顯增多（1.20±0.28 vs.0.48±0.12）（χ2=6.197, P=0.013）。rs28364072 GG基因型攜帶者比AA基因型和AG基因型攜帶者的呼吸道感染次數(shù)明顯增多(1.30±0.34 vs.0.54±0.16, P=0.023;1.30±0.34 vs.0.62±0.14, P=0.030)。rs320995 AA基因型攜帶者的有效率顯著高于G等位基因攜帶者（AA=69.3%, GA=28.

26、6%, GG=15.4%）（χ2=7.996, P=0.015）。rs4980524 CC基因型攜帶者的抗哮喘應(yīng)急藥物使用率顯著高于A等位基因攜帶者（CS使用率:CC=9.1%, AA=3.1%, CA=2.2%;SABA使用率:CC=18.2%, AA=3.1%, CA=2.2%）（χ2=11.105, P=0.021）。rs730012 CA基因型攜帶者的有效率顯著高于AA基因型攜帶者（CA=75.0%, AA=28.0%）（χ2=

27、2.332, P=0.035）。rs730012 CA基因型攜帶者的△FEV1(%)顯著高于AA基因型攜帶者(17.96±3.63 vs.7.61±2.95)（χ2=6.568，P=0.01）。
　　結(jié)論：①吸入型沙美特羅/氟替卡松干粉劑50/100和吸入型布地奈德/福莫特羅干粉劑80/4.5在兒童哮喘中的療效相當(dāng)。②rs1042713、rs2305089、rs2540487、rs2712807、rs28364072、rs3209