肌肉中的糖原脫支酶活力測(cè)定及糖原定量、定性以診斷Ⅲa型糖原貯積癥.pdf

1、背景 糖原貯積癥(Glycogen storage disease,GSD)是一組由于各種不同先天性酶缺陷所導(dǎo)致的糖代謝障礙，至少有12個(gè)分型[1]。其中GSD-Ⅲ為糖原脫支酶(glycogen debranching enzyme，GDE)缺乏而引起的常染色體隱性遺傳病，是GSD中發(fā)病率較高的一型(高于GSD總發(fā)病率的24％[1])，并有a、b、c、d四個(gè)亞型。GDE編碼基因?yàn)锳GL(amyloglucosidase gene

2、)[2]。當(dāng)GDE活性缺乏時(shí)，會(huì)導(dǎo)致大量形態(tài)結(jié)構(gòu)異常的極限糊精在患者的肝臟和/或肌肉中累積，從而引發(fā)各種臨床癥狀，如：肝脾腫大、低血糖、身材矮小、血脂異常、肌肉及肝臟受累等。部分患者可能并發(fā)肝腺瘤甚至肝細(xì)胞癌[3]。肌肉常為進(jìn)行性受累，可累及心肌[1]，嚴(yán)重者可致命[4]。根據(jù)臨床癥狀對(duì)此疾病很難確診，須與之鑒別的病種很多[5]。尤其是GSD-Ⅰ的臨床癥狀與GSD-Ⅲ極為相似，在早期很難分辨。對(duì)AGL基因進(jìn)行分析可以明確診斷，但是AGL

3、有35個(gè)外顯子，全部測(cè)序以尋找突變點(diǎn)耗費(fèi)巨大，應(yīng)用于臨床會(huì)造成患者嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；常見(jiàn)突變點(diǎn)的覆蓋率又小，僅篩查這些突變點(diǎn)會(huì)造成漏診。目前，對(duì)肌肉和/或肝臟的活檢組織進(jìn)行糖原含量測(cè)定、糖原形態(tài)檢測(cè)以及糖原脫支酶的活力測(cè)定是國(guó)際通用的確診及分型依據(jù)，其耗時(shí)短、花費(fèi)少，且能明確診斷。國(guó)內(nèi)大陸還沒(méi)有成熟的酶學(xué)測(cè)定方法，以及中國(guó)人種正常人群的參考范圍。 目的: 本研究的目的便是建立肌肉中GSD-Ⅲa的酶學(xué)診斷以及糖原含量測(cè)定方法

4、，并且制定中國(guó)人種正常值的參考范圍，以在臨床上推廣應(yīng)用。 方法: 1.對(duì)臨床疑診為GSD-Ⅲ的患者進(jìn)行基因分析，以獲得明確的GSD-Ⅲa患者組。 2.制備取得知情同意的56例受試者(正常對(duì)照組35例；GSD-Ⅲa患者組12例；非GSD的其它肌病組9例)的活檢肌肉組織勻漿。 3.以淀粉葡萄糖苷酶降解肌肉勻漿中的糖原，通過(guò)測(cè)定葡萄糖產(chǎn)量以明確糖原含量。 4.以磷酸化酶降解肌肉勻漿中的糖原，通過(guò)測(cè)定葡萄

5、糖產(chǎn)量以明確糖原形態(tài)。 5.以極限糊精為底物，測(cè)定肌肉勻漿中的糖原脫支酶活力。 6.對(duì)12例GSD-Ⅲa患者的臨床資料進(jìn)行綜合分析。 7.應(yīng)用所建立的方法對(duì)4例非Ⅲa型的GSD患者進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。 8.對(duì)肌纖維含脂量高的肌肉標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，觀察脂肪對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。 9.歸納總結(jié)GSD-Ⅲ的診斷參考意見(jiàn)。 結(jié)果: 1.經(jīng)基因分析共確診12例GSD-Ⅲa患者，突變類型有16個(gè)。

6、 2.GSD-Ⅲa患者組的糖原含量、G1P/G(葡萄糖-1-磷酸/葡萄糖總量)比率以及脫支酶活力這三項(xiàng)指標(biāo)與正常對(duì)照組及其他肌病組均存在顯著性差異(p=0.000)。 3.其它肌病組與正常對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)顯著性差異。 4.正常值范圍：糖原百分含量(0.31％~0.43％，g/g)，G1P/G總比率(22.37％~26.43％)，脫支酶活力(0.234U~0.284U)。 5.非Ⅲ型但累及肌肉的GSD患者的脫支酶

7、活力較正常值高。 6.脂肪會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 結(jié)論: 1.肌肉中脫支酶活力檢測(cè)及糖原含量、形態(tài)的測(cè)定方法對(duì)GSD-Ⅲa的診斷效率與基因分析等同。本方法更適合于臨床應(yīng)用，且特異性高，不會(huì)受到其他肌病的影響。 2.本研究于我國(guó)首次成功建立了肌肉中GSD-Ⅲa的酶學(xué)診斷以及糖原含量測(cè)定方法，并測(cè)定出了中國(guó)人群的正常值范圍，可于臨床推廣應(yīng)用。 3.應(yīng)嚴(yán)格控制標(biāo)本質(zhì)量，不得摻雜脂肪組織。對(duì)肌纖維中含脂量高