蘆根乙醇提物對糖尿病小鼠肝臟糖原合成酶及糖原合成酶激酶-3β表達(dá)的影響.pdf

1、近年來的研究表明，中藥作為口服降糖藥中的一個(gè)種類，在糖尿病治療中發(fā)揮了重大的作用，中藥的活性成分在糖尿病的預(yù)防和治療過程中療效穩(wěn)定、毒性小、不良反應(yīng)少、可長期使用。我們通過前期工作已經(jīng)證實(shí)了蘆根乙醇提取物對糖尿病小鼠的降糖調(diào)脂作用，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)肝臟糖原的合成及對糖尿病小鼠肝臟線粒體氧化應(yīng)激的損傷調(diào)節(jié)和保護(hù)作用。眾所周知，糖原合成酶及糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)在這些過程中發(fā)揮著一定的作用，但具體機(jī)制尚不清楚。
　　目的

2、：本實(shí)驗(yàn)擬利用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，觀察蘆根乙醇提物對鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病小鼠肝臟糖原合成酶及糖原合成酶激酶-3β等分子學(xué)指標(biāo)的影響，探討蘆根乙醇提物的具體的降糖機(jī)制，為臨床中草藥對糖尿病的治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　?、偬J根乙醇提物制備：蘆根（干燥）切成1-2cm碎段，浸泡于8倍體積的95％乙醇12h，再分別用6倍體積和5倍體積的95％乙醇回流提取，反復(fù)進(jìn)行3次（每次時(shí)間為2h、1.5h、1h），

3、過濾提取液后合并，濃縮成浸膏，密封保存?zhèn)溆谩?br>　?、赟TZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型的制備：小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后，禁食24h，期間自由飲水；然后腹腔注射檸檬酸緩沖液配制的新鮮STZ溶液,每只小鼠按照每公斤體重40mg計(jì)量（即：40mg/kg）。飼養(yǎng)條件不變，喂養(yǎng)60h后禁食不禁水12h，尾靜脈取血檢測空腹血糖值（FBG），F(xiàn)BG≥11.1mmol/L表明造模成功。
　?、鄯纸M及處理：實(shí)驗(yàn)小鼠共分為正常對照組、模型組、蘆根乙醇提物低劑

4、量組、蘆根乙醇提物高劑量組、藥物對照組。所有小鼠每日灌胃1次，連續(xù)灌胃15d，正常對照組和模型組分別灌胃等體積的蒸餾水1次/d，停藥次日，脫頸處死，迅速剖取肝臟，置于液氮，后轉(zhuǎn)置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　?、躓esten-blotting法檢測糖原合成酶及糖原合成酶激酶-3β蛋白的表達(dá)：取100±2mg備用肝臟組織，按照小量組織蛋白提取試劑盒要求提取總蛋白，后PBS（預(yù)冷）清洗2遍，按100-200uL/g的標(biāo)準(zhǔn)加入預(yù)冷的裂解液，

5、室溫下吹打至均勻，于0℃條件下放置30min，使其充分裂解，全波長分光光度計(jì)測定蛋白樣品濃度。取待測蛋白煮沸2min，加樣40μg/孔，10%SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)到PVDF膜，兔抗小鼠糖原合成酶及糖原合成酶激酶-3β多克隆第一抗體（1：500），4℃過夜，洗滌后加入辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（1：1000），洗膜。圖像分析系統(tǒng)曝光成像，β-actin為參考，計(jì)算糖原合成酶及糖原合成酶激酶-3β蛋白的相對含量。
　?、軷T-P

6、CR法檢測糖原合成酶及糖原合成酶激酶-3β基因的表達(dá)：Primer Premier3.0軟件設(shè)計(jì)兩基因上下游引物。取25±2mg備用肝臟組織，Trizol法提取組織總RNA，核酸蛋白含量測定儀檢測OD260/OD280值在1.7-2.0之間內(nèi)符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，后按照RT-PCR試劑盒要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，圖像分析系統(tǒng)成像，β-actin為參考，計(jì)算兩基因在不同分組中的相對含量。
　　結(jié)果：以β-actin作內(nèi)參照，

7、Western blot檢測后糖原合成酶蛋白表達(dá)的相對值為正常對照組0.22±0.13，藥物對照組0.21±0.11，蘆根乙醇提取物高劑量組0.19±0.10，蘆根乙醇提取物低劑量組0.12±0.10，模型組0.09±0.08。統(tǒng)計(jì)分析后，正常對照組、藥物對照組、蘆根乙醇提取物高劑量組與模型組比較均顯著高于模型組p<0.01，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；蘆根乙醇提取物低劑量組與模型組比較也高于模型組p<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；正常對照組、藥物

8、對照組、蘆根乙醇提取物高劑量組相互間比較，無明顯差異p>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而正常對照組、藥物對照組、蘆根乙醇提取物高劑量組與蘆根乙醇提取物低劑量組比較，高于蘆根乙醇提取物低劑量組p<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異經(jīng)過；RT-PCR擴(kuò)增后的糖原合成酶mRNA正常對照組0.44±0.15，藥物對照組0.42±0.13，蘆根乙醇提取物高劑量組0.40±0.10，蘆根乙醇提取物低劑量組0.22±0.12，模型組0.17±0.16。統(tǒng)計(jì)分析后，正

9、常對照組、藥物對照組、蘆根乙醇提取物高劑量組與模型組比較，均顯著高于模型組p<0.01，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；蘆根乙醇提取物低劑量組與模型組比較也高于模型組p<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；正常對照組、藥物對照組、蘆根乙醇提取物高劑量組相互間比較，無明顯差別p>0.05，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而正常對照組、藥物對照組、蘆根乙醇提取物高劑量組與蘆根乙醇提取物低劑量組比較，均高于蘆根乙醇提取物低劑量p<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Western blo

10、t檢測后糖原合成酶激酶-3β蛋白表達(dá)的相對值為模型組0.14±0.03，蘆根乙醇提取物低劑量組0.13±0.07，蘆根乙醇提取物高劑量組0.10±0.04，藥物對照組0.09±0.02，正常對照組0.07±0.03。統(tǒng)計(jì)分析后，正常對照組、藥物對照組、蘆根乙醇提取物高劑量組與模型組比較p<0.01，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；蘆根乙醇提取物低劑量組與模型組比較p>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；正常對照組、藥物對照組、蘆根乙醇提取物高劑量組相互間比較p

11、>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而正常對照組、藥物對照組、蘆根乙醇提取物高劑量組與蘆根乙醇提取物低劑量組比較p<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。糖原合成酶激酶-3βRT-PCR擴(kuò)增后的糖原合成酶激酶-3βmRNA，模型組0.37±0.05，蘆根乙醇提取物低劑量組0.28±0.09，蘆根乙醇提取物高劑量組0.21±0.07，藥物對照組0.18±0.05，正常對照組0.14±0.07。統(tǒng)計(jì)分析后，正常對照組、藥物對照組與模型組比較p<0.01，具有顯著

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；蘆根乙醇提取物高劑量組與模型組比較p<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；正常對照組、藥物對照組、蘆根乙醇提取物高劑量組相互間比較p>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；蘆根乙醇提取物低劑量組與模型組比較p>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而正常對照組、藥物對照組與蘆根乙醇提取物低劑量組比較p<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，蘆根乙醇提取物高劑量組與蘆根乙醇提取物低劑量組比較p<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.蘆根乙醇提取物可增加S