動(dòng)物肝糖原分子結(jié)構(gòu)及糖原分子生長(zhǎng)中鏈終止機(jī)制初步研究.pdf

1、糖原是動(dòng)物（包括人類）和其他真核生物的關(guān)鍵能量?jī)?chǔ)備。糖原在體內(nèi)分布廣泛，主要集中在肝臟和骨骼肌中，其中肝糖原對(duì)于維持體內(nèi)的血糖平衡有著重要的意義。糖原是一種由葡萄糖組成的高度分枝化的高分子物質(zhì)，可以劃分為三種不同的層級(jí)結(jié)構(gòu)：一級(jí)結(jié)構(gòu)就是每一條鏈，稱之為鏈長(zhǎng)分布。這些鏈?zhǔn)怯善咸烟峭ㄟ^(guò)α-(1,4)鍵形成直鏈，通過(guò)α-(1,6)鍵形成支鏈，平均支鏈的長(zhǎng)度大概是12個(gè)葡萄糖左右。二級(jí)結(jié)構(gòu)是由這些鏈連接起來(lái)形成的結(jié)構(gòu)，稱之為β粒子，β粒子的直徑

2、大概在20 nm左右。三級(jí)結(jié)構(gòu)是由β粒子連接形成的更大的α粒子，α粒子的直徑大概在100 nm左右，其形狀看起來(lái)像西蘭花或者花菜。
　　在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室利用二甲基亞砜（DMSO）相體積排阻色譜（SEC）對(duì)db/db小鼠（一種Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型）的肝糖原進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其肝糖原的組成主要為β粒子，而對(duì)照組的健康小鼠的肝糖原同時(shí)含有相當(dāng)數(shù)量的α粒子和β粒子。結(jié)果表明α粒子的合成在db/db小鼠中是受損的。db/db小鼠肝糖

3、原的這一特異性的結(jié)構(gòu)特征可能具有重要的生理意義，因?yàn)榫哂斜缺砻娣e更大的β粒子的降解速度要高于α粒子，所以db/db小鼠肝糖原中α粒子合成受損可能會(huì)加劇其高血糖的發(fā)生。對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠肝糖原結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)在糖原處于降解狀態(tài)時(shí)主要組成為α粒子，α粒子的形成對(duì)于控制糖原的降解速度有著重要的意義。糖原中α粒子的形成機(jī)制還不明確且存在很多有爭(zhēng)議的說(shuō)法，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)排除了目前存在的幾種假設(shè)并且提出α粒子可能是由β粒子一種或多種蛋白質(zhì)連接形成

4、的。現(xiàn)已證明水相SEC較DMSO相SEC的分離度更好。基于此，本論文進(jìn)一步對(duì)動(dòng)物肝糖原分子結(jié)構(gòu)和糖原分子鏈終止機(jī)制進(jìn)行了深入的研究。
　　本論文由四個(gè)部分組成。
　　第一部分：利用分離精度更好的水相SEC對(duì)db/db小鼠肝糖原的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析并且體外模擬了肝糖原的降解反應(yīng)。水相 SEC的結(jié)果顯示 db/db小鼠肝糖原也含有相當(dāng)數(shù)量的α粒子，但進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)這些α粒子在DMSO中極易降解成更小的β粒子。糖原的體外降解試驗(yàn)結(jié)果顯

5、示β粒子的降解速度要高于α粒子，糖原磷酸化酶對(duì) db/db小鼠和健康小鼠肝糖原的Km值分別為11.88±0.92 mM和41.93±3.43 mM。Km值越小，表明糖原磷酸化酶對(duì)db/db小鼠肝糖原的親和力更高。與前期的研究結(jié)論一致，本論文的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明db/db小鼠肝糖原中α粒子的合成是受損的。不穩(wěn)定的α粒子可能會(huì)加劇高血糖的發(fā)生。
　　第二部分：利用熒光輔助高效毛細(xì)管電泳（FACE）和SEC對(duì)人肝糖原的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，首次報(bào)道

6、了人肝糖原一級(jí)和二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，并且得到了人肝糖原的透射電子顯微鏡（TEM）圖像。人肝糖原的鏈長(zhǎng)分布（CLD）結(jié)果顯示人肝糖原中長(zhǎng)鏈的含量比小鼠肝糖原的高。水相SEC的結(jié)果顯示人肝糖原只含有α粒子。通過(guò)比較人肝糖原和小鼠肝糖原的TEM顯微圖片、分子量分布、α粒子的粒徑以及酸水解的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)人肝糖原的聚集形態(tài)、分子量、α粒子的粒徑大小以及酸性環(huán)境下α粒子的降解方式都與之前報(bào)道的小鼠和豬肝糖原的結(jié)果一致。人肝糖原與小鼠及豬肝相似的糖原酸水解

7、結(jié)果說(shuō)明三者α粒子的鏈接方式是相似的，因此可以合理的推測(cè)存在于db/db小鼠肝糖原中不穩(wěn)定的α粒子也可能存在于患有糖尿病的人的肝糖原中。
　　第三部分：通過(guò)分析人肝糖原和不同時(shí)間點(diǎn)處死的小鼠的肝糖原 CLD并結(jié)合 Wu-Gilbert數(shù)學(xué)模型初步探討了糖原分子的鏈終止機(jī)制。人肝糖原和不同時(shí)間點(diǎn)處死的小鼠的肝糖原的CLD的組成類似，都有線性部分和非線性部分這兩部分組成。這表明糖原分子生長(zhǎng)過(guò)程中存在兩種不同的鏈終止機(jī)制，其中一種機(jī)制已

8、經(jīng)確定是糖原分支酶（GBE），另外一種機(jī)制可是鏈的聚集引起的空間位阻效應(yīng)和GBE或者糖原合成酶（GS）存在兩種及以上的絡(luò)合狀態(tài)。為了驗(yàn)證這兩種可能性，我們用Wu-Gilbert數(shù)學(xué)模型擬合所得到的糖原CLD數(shù)據(jù)，擬合結(jié)果顯示該數(shù)學(xué)模型不能夠很好的擬合糖原的CLD，這表明GBE或GS不存在兩種以上的絡(luò)合狀態(tài)。因此初步確定糖原分子兩種不同的鏈終止機(jī)制是GBE和鏈的聚集引起的空間位阻效應(yīng)。
　　第四部分：本部分從糖原的結(jié)構(gòu)、糖原的合成和