膠原在胃癌發(fā)病中的作用及機制探討.pdf

1、胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一，其相關(guān)疾病死亡率僅次于肺癌，在全球范圍內(nèi)排名第二位。胃癌預(yù)后直接取決于疾病發(fā)現(xiàn)的時期。局限于粘膜層或粘膜下層的早期胃癌是唯一可以治愈的胃癌，早期發(fā)現(xiàn)并手術(shù)切除其5年生存率往往超過90％。但是，胃癌早期缺乏特異性的癥狀，大多數(shù)患者就診時已到晚期，失去最佳手術(shù)時機，常因廣泛的侵襲轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)而死亡。而以現(xiàn)有的診斷手段，一般早期胃癌的檢出率僅15％-20％，遠遠不能滿足臨床需要。
　　 胃癌區(qū)別于正常組織的

2、特征就是其細胞的異型性以及組織浸潤性。然而，細胞形態(tài)學(xué)的異型性可見于胃炎性組織修復(fù)、胃粘膜腸上皮化生和異型增生或瘤樣變，唯有見到異型細胞的組織浸潤才能確認為癌。因此單純通過病理組織形態(tài)學(xué)水平早期診斷胃癌變得較為困難，常常難以確認，這也成為早期胃癌檢出率低的重要原因之一。按照慢性胃炎.萎縮性胃炎-腸上皮化生.不典型增生、胃癌的胃癌變假說來推理，如果對主要的胃癌前病變實施動態(tài)監(jiān)測，從尋找腫瘤浸潤的特征性生物學(xué)行為著手，研究癌前病變癌變的分子

3、生物學(xué)標志物，查找異型細胞浸潤組織的分子證據(jù)，就能夠準確地判別癌前病灶癌變，在病理形態(tài)學(xué)改變前甄別出早期胃癌，達到早期診斷胃癌目的，為早期治療和治愈胃癌奠定堅實的基礎(chǔ)。
　　 基于腫瘤分子水平的診斷及其機制的研究逐漸成為熱點，并已經(jīng)顯示出腫瘤早期診斷及分子干預(yù)特別優(yōu)勢。例如，利用芯片技術(shù)建立了胃癌早期診斷的基因預(yù)警系統(tǒng)和采用小RNA干擾技術(shù)抑制癌變。我們以前的相關(guān)基因芯片篩查結(jié)果顯示，膠原系列的基因表達在胃癌中存在明顯的異常表達

4、。本課題作為深入研究，將基因芯片篩查得到的膠原系列基因進行進一步的定量Real-time PCR技術(shù)檢測，從中篩選可能用于胃癌早期診斷的膠原標記，建立胃癌前病變癌變判別和胃癌早期分子診斷的模型，同時采用現(xiàn)代細胞與分子生物學(xué)技術(shù)，通過體外胃癌細胞模型研究胃癌中高表達I型間質(zhì)膠原在胃癌發(fā)病中的作用機制，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)對胃癌細胞I型膠原實施干預(yù)試驗，研究COLlA1基因?qū)毎飳W(xué)行為的影響及可能機制，為胃癌早期診斷和分子治療提供科學(xué)的依

5、據(jù)。
　　 一材料和方法：
　　 1收集手術(shù)確診的胃癌患者，取同一個體不同區(qū)域胃粘膜組織樣本（癌組織，癌旁癌前病灶及癌切除遠端近似正常的胃組織），通過定量Real-time PCR分三階段檢測8個膠原基因( COLlA1，COLlA2，COL3A1，COL4A6，COL6A3，COL8A1，COL10A1，COL11A1)mRNA在這些組織中的表達情況。使用單因素方差分析或非參數(shù)檢驗逐一分析各個膠原基因在胃癌，癌前病灶及

6、相對正常組織中的組間表達差異。將有判癌價值的膠原系列基因在相對正常，癌前病灶，早期胃癌及進展期胃癌不同個體同類樣本中的表達情況進行Binary Logistic回歸分析（癌與非癌），采用Forward:condiTiO2al法，作胃癌與非癌判別，以建立胃癌早期診斷的分子生物信息學(xué)判別公式。進一步將判別公式在不同個體、不同類別樣本中進行驗證并作修正，以獲得高敏感性、高特異性的判癌公式。
　　 2通過體外細胞模型，探討經(jīng)PCR驗證在

7、胃癌組織中明顯高表達的I型膠原作為細胞生長的微環(huán)境，對胃癌細胞生物學(xué)行為（形態(tài)學(xué)，細胞骨架，遷徙及增殖）的影響，通過檢測相關(guān)通路蛋白及基因的改變探討其可能的作用機制。
　　 3使用COLlAI-shRNA表達載體轉(zhuǎn)染BGC-823胃癌細胞株，干擾癌細胞I型膠原主要基因COLlA1的表達，通過MTT及Transwell檢測研究COLlAlRNA干擾對胃癌細胞增殖及遷移的影響。
　　 二主要結(jié)果：
　　 1①第一階段

8、收集22個胃癌手術(shù)患者男性19例，女性3例，包括腫瘤部位，癌前病變部位及遠端正常部位組織的同個體配對病理樣本66個。8個膠原基因定量Real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與癌旁癌前病變組織配對的樣本比較，除COL10A1外，腫瘤組織中有6個膠原基因( COLlA1，COLlA2，COL3A1， COL6A3，COL8A1，COL11A1)表達明顯上調(diào)（P<0.05）。一個膠原基因(COL4A6)表達下調(diào)(P<0.05)。
　　 ②

9、第二階段收集33個不同疾病狀態(tài)患者包括癌前病變11例，早期胃癌11例，進展期胃癌11例不同個體的共33個配對病理樣本入組。各組均為男性8例，女性3例。7個基因定量Real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與癌前病變組相比，COL11A1在胃癌中表達明顯上調(diào)，尤其在早期胃癌中更明顯（P<0.05），而COL4A6在胃癌中的表達則明顯下調(diào)（P<0.05）。根據(jù)系列膠原基因在胃癌及癌前期病變組織中的相對表達值，采用Binary Logistic回歸

10、分析，作癌與非癌判別，結(jié)果有3個膠原基因( COL11A1，COL8A1，COL4A6)進入回歸方程，初步建立了基于膠原系列基因PCR表達水平的胃癌早期診斷的分子生物信息學(xué)判別公式。
　　 ③第三階段共收集106個不同患者，男性61例，女性45例，采取不同類別的樣本共106個，包括胃鏡檢查基本正常的20例，癌前病變28例，胃癌58例。4個膠原基因在胃癌及癌前病灶組織表達存在統(tǒng)計學(xué)差異，其中COLlA1，1A2，11A1在胃癌組織

11、高表達(P<0.05)，而COL4A6則低表達(P<0.05)。根據(jù)系列膠原基因在胃癌及癌前期病變組織中的相對表達值，對第二階段提出的公式進行驗證，再次經(jīng)過Binary logistic回歸分析修正了基于膠原系列基因PCR表達水平的胃癌癌變預(yù)測公式，修正后公式的敏感性和特異性分別達91.4％和91.7％。
　　 2①體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，常規(guī)培養(yǎng)三株不同分化程度的胃癌細胞株，在膠原刺激后細胞變形，胞體伸展，表面突起增多，呈現(xiàn)明顯增多

12、的絲狀偽足和片狀偽足，細胞內(nèi)微絲明顯拉長增粗。
　　 ②Transwell細胞遷移試驗表明，在外膜涂有I型膠原的小室內(nèi)的胃癌細胞通過膜的細胞較未涂膠原組明顯增多，提示I型膠原可以明顯提高胃癌細胞的遷移能力，這與膠原刺激后細胞形態(tài)學(xué)改變相一致。
　　 ③相關(guān)通路研究提示：膠原刺激主要使E-cadherin/catenin粘附復(fù)合體減少，可溶性的E-cadherin，β-catenin也有輕度下降。提示膠原促進E-cadhe

13、rin/catenin粘附復(fù)合體解聚，破壞細胞間的粘附連接，這些結(jié)果可能與FAK磷酸化，β-catenin酪氨酸磷酸化及與β-catenin結(jié)合的PTEN下調(diào)有關(guān)。
　　 ④MTT試驗表明：胃癌細胞在鋪有膠原的平板內(nèi)生長速度明顯高于未鋪膠原組，提示膠原可促進胃癌細胞增殖。膠原刺激不僅使胃癌細胞β-catenin酪氨酸磷酸化，E-cadherin/catenin復(fù)合體解聚，而且使細胞核內(nèi)β-catenin表達上調(diào)，促使其核轉(zhuǎn)位。且

14、3株分化程度不同的細胞株在膠原刺激后，cyclin D1表達均明顯上調(diào)，尤其是NCI-N87上調(diào)最明顯，達對照組的3倍。
　　 3①我們將已構(gòu)建并經(jīng)測序鑒定的COLlAI-shRNA質(zhì)粒載體進行細胞轉(zhuǎn)染，G418篩選，獲得3個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染COLlAl-shRNA細胞（COLlAl-shRNA-1，COLlAl-shRNA-2，COLlAl-shRNA-3）及陰性載體對照細胞(Negativecontrol)。轉(zhuǎn)染后見部分細胞邊緣圓，

15、細胞核濃縮，細胞中顆粒增多，細胞碎片增多，細胞增殖減慢且易脫落。
　　 ②Real-time PCR結(jié)果示相對于Blank control組，COLlAl-shRNA-1，COLlAI-shRNA-2，COLlAI-shRNA-3轉(zhuǎn)染組細胞COLlAl mRNA的表達明顯下調(diào)，尤以COLlAI-shRNA-1轉(zhuǎn)染組效果明顯，被抑制了8±0.2倍(P<0.01)。
　　 ③MTT試驗表明：COLlAI-shRNA-I轉(zhuǎn)染組

16、細胞增殖減慢，在各實驗點其A值均明顯低于Negative control及Blank control(P<0.05)。
　　 ④Transwell遷移試驗表明：COLlAI-shRNA-1轉(zhuǎn)染組細胞明顯少于Negativecontrol及Blank control，其細胞數(shù)量減少超過3倍以上(P<0.05)，提示COLlA1干擾可明顯抑制胃癌BGC-823細胞遷移。
　　 三結(jié)論：
　　 1發(fā)現(xiàn)2個膠原基因( C

17、OL4A6，COLllAl)可能作為胃癌前病變早期癌變監(jiān)測指標，COLllA1可能是更為敏感的監(jiān)測指標。
　　 2初步建立起了基于膠原系列基因表達水平的胃癌前期病灶癌變判別公式，對臨床早期胃癌的生物學(xué)診斷提出新的診斷模式。
　　 3I型膠原可誘導(dǎo)胃癌細胞骨架重組，促進細胞增殖及遷移，主要與β-catenin酪氨酸磷酸化及核轉(zhuǎn)位有關(guān)。
　　 4成功建立和篩選體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染COLlAI-shRNA的胃癌BGC-823細