Id1在血管瘤發(fā)病中的作用及其機制探討.pdf

1、血管瘤是發(fā)生于嬰幼兒的最常見的良性腫瘤之一，主要由紊亂的血管和大量不成熟的內(nèi)皮細胞組成。發(fā)病率高達10～12％，嚴重影響患兒容貌、受累器官的功能、心理健康等，現(xiàn)代醫(yī)學主張以積極的態(tài)度對該病進行早期治療。但由于對其發(fā)病機制缺乏足夠的認識，致使治療效果整體上差強人意。
　　 Id（DNA結(jié)合抑制因子/分化抑制因子）屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族，它通過作用于多種信號傳導而抑制細胞分化，促進增生和轉(zhuǎn)移，在細胞惡變和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用.哺乳

2、動物細胞含4種Id因子(Id1、Id2、Id3、Id4)，這些因子參與細胞周期調(diào)節(jié)過程，包括細胞發(fā)育、成熟、生長、分化和凋亡等，其中Id1與腫瘤發(fā)生的關(guān)系最為密切。Id1通過抑制細胞分化，推進細胞周期進程、誘導細胞增殖、抑制衰老、誘導侵襲、參與腫瘤性血管新生而介導腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。
　　 鑒于Id1對于腫瘤中血管新生方面的突出作用，筆者將目光鎖定在以大量紊亂的血管及不成熟內(nèi)皮細胞為主要標志的的血管瘤上面。通過臨床標本上檢測Id1

3、在血管瘤中的表達情況，并對體外培養(yǎng)的血管瘤細胞進行RNA干擾，以研究Id1在血管瘤發(fā)病中的作用并對其機制進行探討。
　　 材料與方法:
　　 第一部分:用免疫組化分別檢測12例增生期血管瘤、10例消退期血管瘤、9例血管畸形、7例淋巴管畸形組織及4例動靜脈畸形中的Id1的表達。將增生期血管瘤組織及瘤周正常皮膚組織分別用Trizol裂解液提取總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用Id1引物進行(Real-timeflu

4、orescencequantitativePCR，RFQ-PCR)實驗，檢測兩種組織中Id1基因的mRNA表達情況，再取增生期血管瘤組織及瘤周正常皮膚組織，常規(guī)提取總蛋白，一抗二抗孵育，進行Westernblot實驗，檢測兩種組織中的蛋白表達情況。
　　 第二部分:用組織塊培養(yǎng)的方法培養(yǎng)增殖期血管瘤內(nèi)皮細胞，在細胞生長的對數(shù)期，用設(shè)計好的Id1干擾慢病毒(Id1-RNAi-lentivirus)及空載體慢病毒(Id1-NC-le

5、ntivirus)分別進行轉(zhuǎn)染，用熒光觀測、RFQ-PCR、Westernblot確認干擾成功，用MTT比色法描記干擾前后細胞生長曲線的變化、用TUNEL檢測干擾前后細胞凋亡的改變，用WESTERNblot及PCR檢測干擾前后HIF-1α水平的改變，用免疫組化的方法定性檢測干擾前后iNOS表達的改變;用ELISA檢測干擾前后VEGF的改變。用Tubeformation觀測干擾前后血管瘤內(nèi)皮細胞成管能力的改變。
　　 結(jié)果:

6、>　　 第一部分:免疫組化結(jié)果顯示增生期血管瘤組織中Id1表達整體呈強陽性，陽性率高達90.3％;消退期血管瘤Id1表達整體呈弱陽性趨勢，陽性率53％;血管畸形、淋巴管畸形及動靜脈畸形整體陽性率較弱，依次為52％、57％、53.7％。RFQ-PCR顯示增生期血管瘤組織中Id1的mRNA水平明顯高于瘤周正常皮膚組織。Westernblot顯示增生期血管瘤組織中Id1的蛋白表達水平明顯高于瘤周正常皮膚組織。
　　 第二部分:實驗結(jié)

7、果顯示熒光觀測、RFQ-PCR、Westernblot確認干擾成功。MTT比色法描記的干擾前后細胞生長曲線結(jié)果顯示:干擾后hemECs增殖能力下降，與未干擾組有顯著差異。TUNEL檢測干擾前后細胞凋亡結(jié)果顯示:干擾后hemEC凋亡明顯增多，與未干擾組有顯著差異。RFQ-PCR及WESTERNblot檢測干擾前后HIF-1α含量變化顯示:干擾后HIF-1αRNA水平并無明顯降低，但蛋白含量減少，與未干擾組有明顯差異。免疫組化的方法定性檢測

8、干擾前后iNOS表達的改變，發(fā)現(xiàn)干擾后iNOS整體陽性率下降，陽性強度變?nèi)?。ELISA檢測干擾前后VEGF的改變，結(jié)果顯示，干擾后VEGF的含量減少，與對照組有明顯差異。Tubeformation觀測干擾前后血管瘤內(nèi)皮細胞成管能力的改變，結(jié)果顯示干擾后成管能力下降，且成管持續(xù)時間減少，管壁消退快，與對照組相比有明顯差異。
　　 結(jié)論:
　　 第一部分:實驗結(jié)果提示，Id1在淋巴管畸形、靜脈畸形、動靜脈畸形僅在有管腔結(jié)構(gòu)的

9、部位表達，其余部分不表達或低表達，Id1在增生期血管瘤組織中呈現(xiàn)高表達，在消退期血管瘤中低表達，且表達強度隨消退成分的多少而改變。增生期血管瘤中Id1的表達在RNA水平及蛋白水平均高于瘤周正常皮膚組織，提示Id1在血管瘤發(fā)病中或起重要的作用。
　　 第二部分:結(jié)果顯示沉默Id1后，血管瘤內(nèi)皮細胞的增殖及成血管能力降低，但凋亡增多。而其下游分子HIF-1α、VEGF、iNOS的含量降低，提示干擾Id1之后，導致通路上的因子含量發(fā)生