轉(zhuǎn)錄因子Id1對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、遷移的影響及在損傷血管修復(fù)中作用的研究.pdf

1、1.背景與目的:
　　 血管內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病、介入治療后再狹窄等多種血管性疾病共同的病理生理基礎(chǔ),盡早促進(jìn)受損血管再內(nèi)皮化、恢復(fù)內(nèi)皮功能為抑制血管損傷不良修復(fù)、預(yù)防或防治血管再狹窄及血栓形成的有效策略。因此,揭示內(nèi)皮再生機(jī)理,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞有益再生是損傷性血管疾病治療中亟待解決的問(wèn)題。既往認(rèn)為血管損傷主要依靠損傷部位鄰近的內(nèi)皮細(xì)胞再生修復(fù),但病損情況下鄰近內(nèi)皮的增殖能力有限。近年研究顯示除了血管損傷局部附近內(nèi)

2、皮細(xì)胞再生外,不同來(lái)源的血管前體細(xì)胞同樣是參與損傷內(nèi)皮修復(fù)的重要力量。業(yè)已證實(shí),內(nèi)皮前體細(xì)胞即所稱的內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial precusor cells,EPCs),能“歸巢”于血管損傷處定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞并通過(guò)旁分泌機(jī)制促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)和血管新生。然而,目前對(duì)于調(diào)控EPCs增殖、遷移等生理功能的機(jī)制或某些關(guān)鍵因子在其中的作用尚不完全清楚。
　　 分化抑制因子屬于螺旋-環(huán)-螺旋(Helix-loop-helix,HLH)

3、轉(zhuǎn)錄因子家族,Id包括Id1-Id4四個(gè)亞型,各成員均包括高度保守的HLH結(jié)構(gòu)區(qū),但缺乏堿性DNA結(jié)合區(qū)。Id與其他堿性HLH蛋白(如E2A,E12,E47,c-Myc)形成異二聚體,從而抑制了這些堿性HLH蛋白與DNA及其他組織特異性堿性LHL轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,影響特異性蛋白的表達(dá),抑制細(xì)胞分化。目前發(fā)現(xiàn),Id參與了包括表皮、肌肉、神經(jīng)等多種類細(xì)胞增殖分化及及腫瘤形成,且Id1與骨髓EPCs動(dòng)員等密切相關(guān),但I(xiàn)d是否也對(duì)EPCs功能有調(diào)控

4、作用并參與血管損傷修復(fù)尚不清楚。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):①Id與血管系統(tǒng)發(fā)生密切相關(guān),胚胎發(fā)育中Id1-Id4表達(dá)呈復(fù)雜的時(shí)空模式,但I(xiàn)d1、Id3廣泛表達(dá)且重疊貫穿整個(gè)胚胎腦血管系統(tǒng),Id1/Id3雙基因敲除小鼠由于明顯的血管畸形、分叉障礙導(dǎo)致胚胎E13.5期死亡;②Id參與腫瘤血管新生:Id在內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)表達(dá)導(dǎo)致血管新生,缺失導(dǎo)致促血管生成基因如FGFR-1的下調(diào),而野生型骨髓內(nèi)皮前體細(xì)胞高表達(dá)Id1、Id3,移植后摻合到腫瘤血管床參與血管新生

5、,且Id1、Id3陽(yáng)性表達(dá)與血管密度顯著正相關(guān);③體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,Id能促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖、激活及管樣形成,促血管生長(zhǎng)因子VEGF、TGF-β則誘導(dǎo)HUVEC及骨髓源EPCs表達(dá)Id1和Id3,提示Id1、Id3可能是VEGF等促血管生長(zhǎng)作用的下游關(guān)鍵靶點(diǎn)。研究結(jié)果提示:Id1可能表達(dá)于EPCs,并有調(diào)控其增殖、血管新生的功效,推測(cè)Id1為決定EPCs增殖的一類開(kāi)關(guān)基因,受上游特殊信號(hào)刺激Id1的表達(dá)左右著增殖重要

6、基因的轉(zhuǎn)錄,在EPCs介導(dǎo)的血管損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。
　　 在本課題中,我們將分別從細(xì)胞及在體動(dòng)物水平探討Id1在EPCs增殖、遷移以及血管損傷修復(fù)中的作用。為研究EPCs生理功能的調(diào)控機(jī)制及EPCs在血管損傷修復(fù)中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為深入探討促進(jìn)血管損傷后內(nèi)皮有益再生提供新的思路。
　　 2.方法:
　　 2.1重組腺病毒Ad-Id1的構(gòu)建
　　 由大鼠組織中提取RNA,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到目的

7、基因Id1片段,經(jīng)pMD19T-Simple和AdEasy細(xì)菌內(nèi)同源重組系統(tǒng)構(gòu)建Id1的病毒過(guò)表達(dá)載體,即Ad-Id1,通過(guò)測(cè)序、PCR和酶切鑒定重組病毒Ad-Id1的構(gòu)建。
　　 2.2 Id1對(duì)EPCs增殖、遷移功能的影響
　　 用密度梯度離心法及選擇性培養(yǎng)的方法,體外分離、培養(yǎng)小鼠脾源性EPCs,通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、表面分子標(biāo)志以及Dil-acLDL/FITC-UEA-I雙陽(yáng)性等方法進(jìn)行鑒定;轉(zhuǎn)染Ad-Id1以及si-

8、RNA-Id1,觀察過(guò)表達(dá)或沉默Id1基因?qū)PCs增殖、遷移的作用。
　　 2.3觀察Id1在血管損傷后局部血管壁的表達(dá)及參與血管損傷修復(fù)過(guò)程的作用
　　 用體重為20g-30g的雄性昆明小鼠復(fù)制頸動(dòng)脈損傷模型,通過(guò)熒光定量RT-PCR以及Western blot分別觀察Id1在血管損傷修復(fù)過(guò)程中mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化;將過(guò)表達(dá)Id1的EPCs注入頸動(dòng)脈損傷小鼠尾靜脈,14d后觀察損傷血管局部再內(nèi)皮化及新生內(nèi)膜增

9、殖程度。
　　 3.結(jié)果:
　　 3.1重組腺病毒Ad-Id1的構(gòu)建
　　 由大鼠組織提取RNA,進(jìn)行RT-PCR獲得含酶切位點(diǎn)的Id1基因全CDS區(qū),將目的基因連接到pMD19T-Simple載體中進(jìn)行擴(kuò)增,經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化等步驟后得到pAdTrack-Id1,與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在BJ5183細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行同源重組,通過(guò)篩選、293T細(xì)胞包裝后獲得重組病毒Ad-Id1,經(jīng)鑒定、擴(kuò)增獲得高滴度的Ad-Id

10、1病毒顆粒以用于下一步的實(shí)驗(yàn)。Ad-Id1的病毒滴度約為1.2×1010-2.8×1011 pfu/ml。
　　 3.2 Id1對(duì)體外培養(yǎng)脾源性EPCs增殖、遷移功能的影響
　　 3.2.1脾源性EPCs鑒定
　　 分離培養(yǎng)的脾源性EPCs經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化后向內(nèi)皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變,流式細(xì)胞檢測(cè)Scal-1、VEGFR-2在培養(yǎng)細(xì)胞中的陽(yáng)性率分別為83.5％、57.6％,Dil-acLDL/FITC-UEA-I雙陽(yáng)性細(xì)胞約

11、占90％,說(shuō)明所培養(yǎng)脾源性細(xì)胞是EPCs。
　　 3.2.2 Id1在脾源性EPCs的表達(dá)情況
　　 Id1在脾源性EPCs呈低水平表達(dá),而當(dāng)受到血清或VEGF刺激后,Id1的基因及蛋白水平均明顯增高;靜止?fàn)顟B(tài)下ld1定位表達(dá)于EPCs細(xì)胞漿內(nèi)。
　　 3.2.3基因轉(zhuǎn)染脾源性EPCs
　　 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞狀態(tài)良好,貼壁生長(zhǎng),無(wú)變圓、縮小或脫落等病理跡象,經(jīng)過(guò)熒光倒置顯微鏡、RT-PCR以及Western b

12、lot觀察發(fā)現(xiàn)Ad-Id1的轉(zhuǎn)染效率在第24小時(shí)約60％,48-72小時(shí)達(dá)高峰,約80％。Si-RNA-Id1轉(zhuǎn)染后4天,Id1在EPCs的表達(dá)被顯著抑制,轉(zhuǎn)染率約50％。
　　 3.2.4 Ad-Id1對(duì)EPCs增殖的作用
　　 采用MTT法分析發(fā)現(xiàn),Ad-Id1對(duì)EPCs增殖顯著影響。無(wú)論與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組還是Ad-GFP對(duì)照組比較,Ad-Id1對(duì)EPCs的增殖有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均*P＜0.05),提示Ad-Id1對(duì)EPCs

13、有促進(jìn)增殖的作用。
　　 3.2.5 Ad-Id1對(duì)EPCs遷移的作用
　　 外源性Id1過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)EPCs遷移。在Ad-Id1作用誘導(dǎo)下,平均每個(gè)視野中遷移EPCs的數(shù)目從7.1±1.8增加到26.1±2.8,增加了近3倍(*P＜0.01)。加入Id1封閉性抗體Id1-Ab后,Ad-Id1促遷移作用明顯減弱(＃P＜0.05),提示EPCs遷移能力的增強(qiáng)是過(guò)表達(dá)Id1導(dǎo)致。
　　 3.2.6利用小片段RNA(

14、si-RNA)干擾沉默Ad-Id1對(duì)EPCs增殖、遷移的影響
　　 結(jié)果表明si-RNA-Id1介導(dǎo)的Id1基因的沉默明顯抑制了EPCs的增殖、遷移功能,與未干預(yù)組及陰性對(duì)照組比較均有顯著差異(*p＜0.05)。
　　 3.3 Id1在血管損傷修復(fù)中的表達(dá)及作用
　　 3.3.1小鼠頸動(dòng)脈損傷模型的建立
　　 經(jīng)損傷血管組織切片H&E染色證實(shí),本研究成功復(fù)制了小鼠頸動(dòng)脈損傷模型,鏡下觀察到血管損傷后7天局

15、部?jī)?nèi)膜有增生,14天時(shí)新生內(nèi)膜增生明顯,到28天新生的內(nèi)膜幾乎堵塞整個(gè)血管腔。內(nèi)膜/中膜比值(IA/MA)14d組為1.30±0.15,28d組為4.10±0.20較損傷7d組的0.28±0.02顯著增加(分別為P＜0.01,P=0.000)。
　　 3.3.2 Id1在血管損傷局部血管壁的表達(dá)
　　 免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示Id1在損傷血管的新生內(nèi)膜、中膜以及外膜組織均有表達(dá)。Id1mRNA在正常血管組織低表達(dá),血管損傷后表達(dá)

16、迅速上升,114d即達(dá)到高峰,之后逐漸下降維持到血管損傷后第28天仍較對(duì)照組高。Western blot檢測(cè)到Id1蛋白表達(dá)在血管損傷后第7d開(kāi)始上調(diào),14d時(shí)達(dá)到高峰,然后逐漸回落,在損傷后第28天仍有表達(dá)。
　　 3.3.3移植過(guò)表達(dá)Id1的EPCs對(duì)損傷血管再內(nèi)皮化的影響
　　 損傷14d時(shí)Ad-Id1-EPCs轉(zhuǎn)染組再內(nèi)皮化率為68.36±4.51％,而Ad-GFP-EPCs轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組再內(nèi)皮化率分別為43.

17、1±6.59％、40.5±7.82％,兩者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但與Ad-Id1-EPCs轉(zhuǎn)染組比較均存在明顯差異(P＜0.05),說(shuō)明轉(zhuǎn)染Id1過(guò)表達(dá)的EPCs可促進(jìn)第14d時(shí)損傷血管再內(nèi)皮化。
　　 3.3.4移植過(guò)表達(dá)Id1的EPCs對(duì)損傷血管局部新生內(nèi)膜增殖的影響
　　 血管損傷后第14d,Ad-Id1-EPCs轉(zhuǎn)染組小鼠損傷頸動(dòng)脈內(nèi)、中膜比值為1.08±0.15,結(jié)果與Ad-GFP-EPCs組(1.16±0.14)

18、及未轉(zhuǎn)染組(1.15±0.17)比較三組之間比較無(wú)明顯差異(P＞0.05),而三組中膜面積均無(wú)明顯差異(P＞0.05),提示轉(zhuǎn)移植表達(dá)Id1的EPCs未減輕血管損傷后新生內(nèi)膜的增殖程度。
　　 4.結(jié)論:
　　 4.1 Id1在靜止?fàn)顟B(tài)的脾源性EPCs呈低表達(dá),定位于細(xì)胞漿內(nèi);
　　 4.2 Id1影響EPCs增殖、遷移功能:過(guò)表達(dá)Id1可促進(jìn)EPCs的增殖、遷移,干擾Id1則抑制EPCs的增殖、遷移;