微小RNA miR-141在胃癌發(fā)病中的作用.pdf

1、微小RNA(microRNAs，miRNAs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長約21-25個核苷酸的內源性單鏈非編碼RNA，在動植物中均有表達。miRNAs通常與靶mRNAs的3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslatedregion，3’-UTR)互補結合，在轉錄后水平抑制靶基因的表達。miRNAs調節(jié)細胞增殖、凋亡、分化以及遷移等重要的生物學過程。miRNAs表達和代謝的異常還與多種疾病，比如腫瘤密切相關。一些miRNAs在腫瘤組織中表達異常，

2、促進了腫瘤的發(fā)生和進展，其作用相當于癌基因或抑癌基因。目前，已有證據提示miRNAs可應用于腫瘤的基因診斷和治療。 應用高通量的生物芯片技術，科學家已在多種人類腫瘤，如肺癌、乳腺癌、肝癌、食管癌和前列腺癌等中篩選出表達異常的miRNAs。其中，Hsa-m1R-141(miR-141)作為miR-200家族的成員之一，在乳腺癌、結直腸癌細胞株和膽管癌細胞株中表達增高，而在前列腺癌、肝細胞肝癌和腎細胞癌中表達降低。異常表達的miR-

3、141參與了膽管癌細胞的增殖和腎癌細胞的侵襲活動，提示miR-141與多種腫瘤的發(fā)病機制相關。 胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一，是男性腫瘤的第二死因，女性腫瘤的第三死因。2008年，美國新增的胃癌患者估計有21，500例，新增的胃癌死亡患者約10，880例。在中國每年新增約36-40萬胃癌患者，死亡率占據我國腫瘤死因的第二位。但是，我們對胃癌發(fā)病機制尚缺乏全面和深入的了解。最近研究發(fā)現(xiàn)miR-106b-25簇、miR-21和miR

4、-27a在胃癌中的表達增加；同時，腸型胃癌和未分化型胃癌均有特征性的miRNAs表達譜，提示miRNAs與胃癌的發(fā)病機制有密切的聯(lián)系。 在本課題中，我們利用生物芯片技術篩選在胃癌組織和癌遠端非腫瘤組織中差異表達的miRNAs，并通過定量Real-timePCR技術檢測miR-141在胃癌患者腫瘤組織和胃癌細胞株中的表達狀態(tài)；同時采用現(xiàn)代細胞與分子生物學技術，通過體外胃癌細胞模型研究miR-141在胃癌發(fā)病機制中的作用，為胃癌早期

5、診斷和尋求藥物靶點提供科學的依據。 1材料和方法： 1.1收集胃癌患者手術組織樣本，通過miRNAs芯片篩選在胃癌組織及癌遠端非腫瘤組織中差異表達的miRNAs，并用定量Real-timePCR驗證miR-141的表達情況。然后使用獨立樣本t檢驗和單因素方差檢驗分析miR-141表達水平與各臨床病理參數之間的相關性。 1.2使用定量Real-timePCR分析5株胃癌細胞株中miR-141的表達情況，結合細胞的增

6、殖和分化特征，篩選合適的胃癌細胞株。 1.3使用miR-141precursormolecule轉染方法在MGC-803胃癌細胞內過量表達miR-141，通過相差顯微鏡觀察以及MTT檢測研究過量表達miR-141對細胞增殖的影響。 1.4使用生物信息學方法(如miRanda，Pictar，Targetscan等)預測miR-141靶基因，結合既往文獻篩選與胃癌發(fā)病機制相關的靶基因，并進行初步驗證。 2主要結果：

7、 2.1生物芯片結果發(fā)現(xiàn)，與癌遠端非腫瘤組織相比，胃癌組織中的miR-141下調了大約12.0倍。使用定量Real-timePCR發(fā)現(xiàn)在80％的胃癌組織樣本中miR-141的表達水平下調，平均下降2.1倍(P＜0.01)。但miR-141的表達水平與各臨床病理參數之間無顯著相關性。 2.2篩選出來源于胃癌的MGC-803細胞株為合適的體外細胞模型。用miR-141precursor轉染MGC-803細胞后，細胞中miR-1

8、41的表達上調了大約7×104倍；而pre-miRnegativecontrol轉染的細胞在熒光顯微鏡下幾乎均顯示為紅色，提示miR-141precursor在MGC-803細胞中轉染成功且過量表達了miR-141。 2.3用相差顯微鏡和MTT法觀察miR-141precursor過量表達48小時和72小時后的MGC-803細胞。與pre-miRnegativecontrol轉染組相比，兩種方法均提示miR-141precurs

9、or轉染組細胞的增殖受到顯著抑制(48小時，P<0.05；72小時，P<0.01)。 2.4使用生物信息學方法分析，預選出miR-141的靶基因是FGFR2和ZEB2。但定量Real-timePCR檢測未顯示過量表達miR-141的MGC-803細胞內FGFR2和ZEB2的mRNA水平有顯著改變。 3結論： 3.1基因芯片和定量Real-timePCR發(fā)現(xiàn)在胃癌患者的腫瘤組織中，miR-141的表達水平與癌遠端非