miR-141抑制HCV誘導(dǎo)的脂質(zhì)累積的機(jī)制研究.pdf

1、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染為全球流行性疾病，嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康。目前HCV感染所致的慢性肝臟疾病已成為重要的健康問(wèn)題，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)HCV感染者約1.7億，每年的新生病例至少為300～400萬(wàn)。此外，在HCV的急性感染期人群中，大于80％的急性感染患者因無(wú)法完全清除體內(nèi)病毒而進(jìn)入慢性感染期，并隨后導(dǎo)致更加嚴(yán)重的并發(fā)癥以及大面積的肝臟損傷，如誘發(fā)肝硬化和肝細(xì)胞癌。目前抗HCV

2、藥物價(jià)格昂貴并存在副作用，至今尚無(wú)有效的疫苗。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類(lèi)小的、內(nèi)生性的、非編碼RNA，能夠靶向人類(lèi)將近60%的mRNA，發(fā)揮廣泛的生物學(xué)作用，被認(rèn)為是疾病療領(lǐng)域的“新靶標(biāo)”。
　　已有大量研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染能夠改變宿主細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜，這些miRNA與HCV的生命周期密切相關(guān)。我們前期研究首次發(fā)現(xiàn)，miR-141在HCV感染者的外周血中表達(dá)較健康人群明顯降低。但miR-141在HCV感

3、染中的作用及其機(jī)制缺乏全面而深入的研究。本研究旨在鑒定miR-141在HCV感染中的生物學(xué)作用及機(jī)制，為深入了解HCV的致病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的HCV治療靶標(biāo)和提高療效打下基礎(chǔ)。在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，我們將進(jìn)一步運(yùn)用高表達(dá)miR-141細(xì)胞系模型，揭示miR-141在HCV感染過(guò)程中的作用及具體機(jī)制。本研究包括以下內(nèi)容：
　　目的：實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，體外高表達(dá)miR-141能夠抑制HCV感染的Huh7細(xì)胞培養(yǎng)上清中病毒的滴度，同時(shí)

4、上調(diào)干擾素β（IFN-β）的表達(dá)，但具體機(jī)制尚不明確。HCV的整個(gè)生命周期均和脂代謝密切相關(guān)，我們的研究發(fā)現(xiàn)miR-141能夠抑制由于HCV感染所致的宿主細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)累積，因此，本研究旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)一步探討miR-141對(duì)HCV感染所誘導(dǎo)的脂質(zhì)累積的影響及機(jī)制。
　　方法：
　　1.收集HCV陽(yáng)性病人外周血標(biāo)本以及健康人血標(biāo)本各52例，定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)血漿中miR-141的表達(dá)情況；
　　2.

5、 Western Blot檢測(cè)HCV蛋白core、NS5A的表達(dá)；
　　3.油紅O染色檢測(cè)高表達(dá)miR-141及對(duì)照細(xì)胞系中感染HCV前后脂滴水平；
　　4.定量PCR和 Western Blot檢測(cè)脂代謝中重要分子，包括固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（Sterol Regulatory Element Binding Protein,SREBP-1,SREBP-2），脂肪酸合成酶（Fatty Acid Synthase,FASN）、

6、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA Reductase,HMGCR）、低密度脂蛋白受體（Low-Density Lipoprotein Receptor,LDLR）等的表達(dá)情況；
　　5. Western Blot檢測(cè)同IFN激活密切相關(guān)的c-Jun氨基末端激酶通路（JNK Pathway）中的分子，絲裂原活化蛋白激酶激酶4(Mitogen Activated P

7、rotein Kinase Kinase，MAP2K4)、絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4(Mitogen Activated Protein Kinase Kinase Kinase Kinase,MAP4K4)以及c-Jun蛋白水平的表達(dá)；檢測(cè)IFN-β下游IFN刺激因子（IFN stimulate gene,ISGs），包括參與脂代謝的ISG膽固醇-25-羥化酶（Cholesterol25-Hydroxylase,CH25H）的m

8、RNA及蛋白表達(dá)水平；
　　6.用CH25H代謝產(chǎn)物25HC處理Huh7細(xì)胞系，比較HCV的感染情況及細(xì)胞中脂滴含量。
　　結(jié)果：與健康人血清標(biāo)本相比，HCV陽(yáng)性患者的血漿標(biāo)本中miR-141呈顯著低表達(dá)。利用慢病毒構(gòu)建的穩(wěn)定高表達(dá)miR-141的Huh7細(xì)胞系中，高表達(dá)miR-141后顯著抑制HCV core和NS5A的表達(dá)，并且能夠抑制由于病毒感染所致的細(xì)胞內(nèi)脂滴的累積；我們檢測(cè)了脂質(zhì)代謝中相關(guān)分子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)mi

9、R-141能夠顯著抑制SREBP-1的蛋白表達(dá)水平和SREBP-1、SREBP-2、HMGCR、FASN、LDLR的mRNA水平。我們通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)干擾素刺激因子CH25H能夠催化膽固醇為可溶性的25HC，25HC通過(guò)抑制脂質(zhì)代謝從而抑制多種有包膜病毒的進(jìn)入過(guò)程。通過(guò)檢測(cè) IFN通路中相關(guān)分子發(fā)現(xiàn)，miR-141能夠顯著上調(diào)JNK通路中重要的激酶MAP2K4和MAP4K4的表達(dá)及其下游c-Jun的磷酸化水平，進(jìn)而增強(qiáng)了IFN-β啟

10、動(dòng)子的活性，干擾素途徑下游的ISG56、ISG15和CH25H表達(dá)均升高。用CH25H的代謝產(chǎn)物25HC處理細(xì)胞后顯示出了抗病毒效應(yīng)并逆轉(zhuǎn)了HCV感染誘導(dǎo)的脂質(zhì)累積，同miR-141發(fā)揮相似的作用。
　　結(jié)論：HCV感染后患者血漿中miR-141呈低表達(dá)，而體外高表達(dá)miR-141能夠抑制HCV的core和NS5A的表達(dá)，這提示，miR-141在HCV的生命周期中發(fā)揮重要的作用，而HCV對(duì)miR-141表達(dá)的抑制作用可能是其維持自

11、身生命周期的機(jī)制之一。HCV的整個(gè)生命周期均和脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，HCV感染常常誘導(dǎo)肝臟中脂質(zhì)累積從而導(dǎo)致肝脂肪變性。我們的研究發(fā)現(xiàn)，體外高表達(dá)miR-141能夠抑制由于HCV感染所誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積。通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，miR-141能夠通過(guò)JNK通路激活I(lǐng)FN-β及其下游ISGs的表達(dá)，其中的一種ISG為CH25H，它能夠?qū)⒛懝檀夹揎棾蔀榭扇苄缘?5HC，從而抑制細(xì)胞中脂質(zhì)合成和某些病毒的感染。這提示miR-141可能通過(guò)IF