IFN-λ1在嗜甲醇酵母中的表達(dá)、純化和活性測定以及其受體信號通路的研究.pdf

1、IFN-λs是最新發(fā)現(xiàn)的一類具有抗病毒活性的干擾素樣細(xì)胞因子，包括IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)和IFN-λ3(IL-28B)。IFN-λs在基因結(jié)構(gòu)上與IL-10家族十分相似，而在氨基酸組成和功能方面與Ⅰ型IFN更為接近，在IL-10家族和Ⅰ型IFN之間建立了進(jìn)化上的聯(lián)系。IFN-λs，尤其是IFN-λ1，具有開發(fā)成廣譜抗病毒藥物的潛在價(jià)值，為此開展了該干擾素基因的克隆、表達(dá)、生物活性檢測和有關(guān)信號蛋白相互作

2、用的研究。 本論文中通過RT-PCR從人外周血淋巴細(xì)胞中克隆了IFN-λ1cDNA，其序列與GenBank的報(bào)道有一個(gè)堿基的差異，但氨基酸序列完全一致。為了大量獲得IFN-λ1蛋白，IFN-λ1cDNA先后被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌和酵母表達(dá)體系中。在大腸桿菌中，IFN-λ1的表達(dá)水平極低，這可能與密碼子偏愛性或IFN-λ1對大腸桿菌的毒性有關(guān)。隨后IFN-λ1cDNA以串聯(lián)多拷貝的形式轉(zhuǎn)化到甲醇營養(yǎng)酵母Pichiapastoris中，并

3、通過α因子前導(dǎo)肽分泌到胞外，表達(dá)水平約為28mg/L。理論上，重組IFN-λ1(rhIFNλ1)前體蛋白將受到酵母KEX2蛋白酶的切割，釋放出與天然IFN-λ1一級結(jié)構(gòu)完全相同的重組蛋白。但WesternBlotting和氨基酸測序發(fā)現(xiàn)rhIFN-λ1受到不明蛋白酶的加工，產(chǎn)生了具有不同N末端的三種蛋白，其中兩種蛋白N端帶有殘留的α因子前導(dǎo)肽序列，第三種蛋白N端缺失了13個(gè)氨基酸殘基。這可能是因?yàn)镮FN-λ1的N末端氨基酸Pro屬于強(qiáng)剛

4、性氨基酸，抑制了KEX2在其識別序列DKR羧基端的剪切。用FPLCSPSepharoseFastFlow層析柱純化了rhIFN-λ1，回收率大于70％。純化的蛋白能夠有效上調(diào)Hela細(xì)胞內(nèi)磷酸化STAT1(pY-STAT1)的水平，表明IFN-λ1的N端缺失或冗余不會對激活STAT1造成太大的影響。 IFN-λs受體隸屬于Ⅱ型細(xì)胞因子受體家族(CRF2)，由兩個(gè)亞基構(gòu)成，即CRF2-12和CRF2-4。其中CRF2-12是IFN

5、-λs受體特有的亞基，CRF2-4最早是作為IL-10受體(IL-10R)的小亞基被發(fā)現(xiàn)的，故又稱為IL-10R2，同時(shí)CRF2-4還是IL-22R和IL-26R的共有亞基。通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，CRF2-12胞內(nèi)區(qū)含有一個(gè)TRAF6結(jié)合位點(diǎn)，并有眾多的激酶位點(diǎn)。為了驗(yàn)證CRF2-12與TRAF6的相互作用，我們構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX-6P-TRAF6和真核表達(dá)載體pCMV-Myc-CRF2-12、pBudCE4-TRAF6，并從

6、體內(nèi)和體外兩方面對CRF2-12與TRAF6的相互作用作了驗(yàn)證。GSTpul1-down試驗(yàn)證明CRF2-12可直接與TRAF6結(jié)合，雙向免疫共沉淀試驗(yàn)也證實(shí)了CRF2-12與TRAF6之間存在特異的相互作用。同時(shí)，胞內(nèi)試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與TRAF6共表達(dá)時(shí)，CRF2-12的表達(dá)水平顯著上升，表明TRAF6可促進(jìn)CRF2-12的表達(dá)或增加CRF2-12的穩(wěn)定性。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無論是否共轉(zhuǎn)染了TRAF6基因，293T細(xì)胞內(nèi)CRF2-12的

7、mRNA含量維持在相對穩(wěn)定的水平，因此，TRAF6并非CRF2-12的轉(zhuǎn)錄激活因子。在CRF2-12和TRAF6充分表達(dá)后，使用高濃度放線菌酮抑制兩種蛋白的繼續(xù)合成，WesternBlotting證明TRAF6可明顯延長CRF2-12蛋白的半衰期，這可能是因?yàn)門RAF6結(jié)合后封閉了CRF2-12的一些蛋白酶作用位點(diǎn)，從而降低了CRF2-12降解的速度。 上述研究結(jié)果為促進(jìn)IFN-λ1的應(yīng)用研究，為開展IFN-λ1的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)