肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A1在甲醇酵母中的表達(dá)與純化.pdf

1、呼吸窘迫綜合征(RDS)是導(dǎo)致早產(chǎn)兒死亡的主要因素并與一定的遺傳背景有關(guān).PS替代治療是唯一有效的治療手段.與RDS同樣,肺表面活性物質(zhì)(PS)的功能或成分的改變與其它呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān),如成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、特異性肺纖維化(IPF)和肺部感染.目前臨床使用的PS主要為動(dòng)物肺組織和人羊水中提取物,價(jià)格昂貴,不能滿足臨床的需要,因此人工合成磷脂和基因工程產(chǎn)物生產(chǎn)PS將是獲得PS的最佳途徑.該研究將正常中國(guó)人的SP-A1基因分別克

2、隆至酵母分泌表達(dá)載體pPIC9K和胞內(nèi)表達(dá)載體pPIC3.5K中,轉(zhuǎn)化至甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母Pichiapastoris系統(tǒng),獲得HIS+Mut+和HIS+Muts的重組體,經(jīng)過(guò)G418抗性篩選.篩選出高拷貝重組體.以甲醇誘導(dǎo),篩選高效表達(dá)的重組菌種.通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件,目標(biāo)產(chǎn)物在搖瓶發(fā)酵液中高效表達(dá),可達(dá)200mg/L.將篩選到的高效表達(dá)的重組菌種轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵、誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)過(guò)離心和超濾,得到粗提SP-A1,再經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾層析和高效液