hBMP-7的定點(diǎn)突變及其在甲醇酵母中的表達(dá)鑒定.pdf

1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenesis Proteins,BMPs)是一類蛋白質(zhì)生長(zhǎng)因子,在動(dòng)物(包括人類)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)組織器官的決定與分化起重要作用.骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP7)又稱成骨蛋白-1(Osteogenic Protein-1,OP-1)具有促使細(xì)胞組織分化形成骨組織的作用.該研究嘗試建立hBMP7成熟片段在畢赤酵母(Pichiapastoris)中的表達(dá)技術(shù).主要研究工作包括:將hBMP7全長(zhǎng)cDNA

2、的成熟片段克隆到分泌型表達(dá)載體質(zhì)粒pPIC9K多克隆位點(diǎn)上,構(gòu)建能表達(dá)hBMP7成熟肽的載體質(zhì)粒;以這一表達(dá)載體為基礎(chǔ),依據(jù)酵母密碼子使用偏好性,將hBMP7成熟片段內(nèi)3個(gè)酵母使用頻率為O的精氨酸密碼子突變?yōu)槭褂妙l率較高的同義密碼子AGA,以期實(shí)現(xiàn)高效表達(dá);表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化酵母宿主菌株KM71,PCR鑒定基因整合后,搖瓶培養(yǎng),甲醇誘導(dǎo)表達(dá)并用點(diǎn)雜交快速篩選高表達(dá)菌株.搖瓶表達(dá)上清經(jīng)Tricine-PAGE分析表明在18KD處有一新增條帶;

3、Western-Blotting表明該條帶具有良好的抗原性和特異性,證實(shí)為hBMP7,重組產(chǎn)物的理論分子量為15.6KD,實(shí)際值為18KD,推測(cè)產(chǎn)物帶有一定程度的糖基化修飾,重組產(chǎn)物以單體形式存在,沒(méi)有檢測(cè)到預(yù)期的二聚體形式.利用蛋白質(zhì)Bradford總蛋白定量,結(jié)合Glyko BandScan量化軟件的分析發(fā)現(xiàn),表達(dá)上清中特異性蛋白的表達(dá)量可達(dá)到25.45μg/ml,占總蛋白含量的76.2％;密碼子優(yōu)化使rhBMP7搖瓶培養(yǎng)表達(dá)量較未