黃酒釀酒酵母芳香醇脫氫酶的定點突變與催化位點鑒定.pdf

1、在黃酒發(fā)酵過程中，尤其在釀酒酵母參與的氨基酸代謝的埃里希(Ehrlich)途徑中，釀酒酵母通過Ehrlich途徑將苯丙氨酸等五種芳香族和脂肪族氨基酸代謝為2-苯乙醇等相應(yīng)的雜醇，這些雜醇在酵母發(fā)酵食品以及飲品的風(fēng)味品質(zhì)構(gòu)成中起決定性作用。Ehrlich途徑的最后一步是關(guān)鍵酶催化α-醛酮還原為相應(yīng)的醇，研究表明，釀酒酵母的七個預(yù)測芳香醇脫氫酶(AAD)Aad3、Aad4、Aad6、Aad10、Aad14、Aad15和Aad16是催化Ehr

2、lich通路最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵候選基因。
　　釀酒酵母基因組中的七個芳香醇脫氫酶的Aad4和Aad14可以編碼有活性的蛋白，但是Aad3、Aad10、Aad6/Aad16和Aad15在進化過程中可能經(jīng)歷了一些進化事件（堿基突變），不能編碼有活性的蛋白。所以本研究通過對Aad3、Aad6、Aad10進行生物信息學(xué)分析之后，想要探究這幾個酶在進化過程是否存在過活性。將生物刻畫的相對詳細(xì)的Pc（Phanerochaete chrysos

3、porium，黃孢原毛平革菌）作為參照，試驗通過分子信息學(xué)的分析后對Aad3、Aad10、Aad6各自關(guān)鍵的催化位點進行定點突變，克隆，在大腸桿菌中表達，最后通過親和層析純化了帶有His-標(biāo)簽的融合蛋白。對純化獲得的融合蛋白進行酶活測試，根據(jù)酶活參數(shù)的分析，以探究假設(shè)這幾個酶的關(guān)鍵氨基酸位點以及在進化過程中存在活性的正確性。試驗得到以下結(jié)論:
　　(1)確定了酪氨酸是Aad蛋白的關(guān)鍵位點;(2)除了酪氨酸Tyr73位點的突變外，也