人RhoGDI2的7個定點突變體的活性研究及其在人乳腺癌中的表達(dá)模式分析.pdf

1、RAS GTP酶超家族參與了很多細(xì)胞過程，包括細(xì)胞生長的控制，基因表達(dá)，細(xì)胞骨架的重排，微管的組織，膜泡和核的轉(zhuǎn)運，細(xì)胞的生存以及細(xì)胞內(nèi)的信號調(diào)節(jié)等過程，它們和人類的多種疾病特別是惡性腫瘤相關(guān)。RAS超家族共分成五個亞家族，它們分別是Ras，Rho，Rab，Ran和Arf。其中Rho亞家族GTP酶參與了細(xì)胞骨架的構(gòu)建，基因表達(dá)和酶活性的調(diào)節(jié)等很多關(guān)鍵步驟。它們和其它RAS超家族的成員一樣，通過結(jié)合GTP或者GDP而起到分子開關(guān)的作用。當(dāng)

2、形成GTP結(jié)合狀態(tài)時Rho GTP酶處于活性狀態(tài)，而和GDP結(jié)合時則處于非活性狀態(tài)。Rho GTP酶在這兩種狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換依賴于一些調(diào)節(jié)因子。RhoGDIs (Rho GDP-Dissociation Inhibitors，Rho GTP酶的GDP解離抑制因子)是其中一類非常關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。RhoGDIs的主要功能是抑制GDP從Rho GTP酶上解離下來，使后者處于非活性狀態(tài)。 Rho GTP酶在Rho-ROCK，JNK等信號途

3、徑中起著關(guān)鍵的作用。因此，它們在活性和非活性兩種狀態(tài)之間的平衡顯得非常重要。已經(jīng)有大量的實驗證明，RhoGTP酶(如RhoC，RhoA，Rac1，CDC42等)的過度表達(dá)和活化會啟動基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞分裂，導(dǎo)致細(xì)胞生長和遷移的能力大大增強，從而使細(xì)胞發(fā)生癌變。另外一些研究表明，在休眠的細(xì)胞中，大部分Rho GTP酶處于GDP結(jié)合的非活性狀態(tài)，在細(xì)胞質(zhì)中以和RhoGDIs形成復(fù)合物的形式存在。由此可見，Rho GTP酶維持在非活性狀態(tài)對于

4、細(xì)胞維持正常的生理和生物學(xué)功能很關(guān)鍵。 RhoGDI2是RhoGDIs家族的一個成員，它作為Rho GTP酶關(guān)鍵的活性調(diào)節(jié)因子之一，也得到了人們普遍的重視。近年來人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)RhoGDI2和腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)。Gildea等在2002年底第一次發(fā)現(xiàn)并用實驗證明了在人類膀胱癌中RhoGDI2起抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，引起了人們極大的關(guān)注。但是該基因和腫瘤的關(guān)系從目前看來還很撲朔迷離。有些研究認(rèn)為RhoGDI2在乳腺癌，人骨肉瘤細(xì)胞癌

5、，口腔上皮癌和卵巢癌中表達(dá)升高，張等在2006年6月發(fā)現(xiàn)RhoGDI2在乳腺癌中促進(jìn)了腫瘤浸潤。而另外一些研究則證明RhoGDI2可以在膀胱癌和直腸癌細(xì)胞株中起到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的功能。RhoGDI2和腫瘤之間關(guān)系的研究才剛剛起步，越來越多的人對這個基因發(fā)生興趣。 本文中我們首先根據(jù)已有RhoGDI2的文獻(xiàn)以及晶體結(jié)構(gòu)分析的報道，挑選了7個可能和RhoGDI2的GDP解離抑制因子功能相關(guān)的位點，采用體外定點突變的方法，分別制備了7個

6、不同的RhoGDI2定點突變體。體外表達(dá)純化野生型RhoGDI2和定點突變體蛋白質(zhì)后，分別檢測了它們和RhoA的結(jié)合能力，以及它們抑制RhoA的GDP解離的功能的變化。和RhoA的結(jié)合實驗表明，其中一個突變體LL(52，53)SS和RhoA的結(jié)合能力明顯下降，其它6個突變體的結(jié)合能力則沒有明顯的降低。GDP解離抑制實驗的結(jié)果顯示所得到的7個定點突變體的GDP解離抑制能力下降都很明顯。最為突出的是SL(44，45)AA，LL(52，53)

7、SS，DD(181，182)從，這三個定點突變體的GDP解離抑制功能幾乎完全消失。RhoGDIs家族的保守性非常高，因此這個結(jié)果可能提示我們，RhoGDI2蛋白質(zhì)活性對其氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的要求很嚴(yán)格，故某些甚至1個重要位點發(fā)生突變都易導(dǎo)致其功能的減弱或消失。另外，為了了解RhoGDI2與乳腺癌的相關(guān)性，我們在5個轉(zhuǎn)移能力不同的乳腺癌細(xì)胞株和71例乳腺癌病人組織中檢測了RhoGDI2蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。腫瘤組織切片的免疫組化和細(xì)胞學(xué)研究

8、的結(jié)果一致表明RhoGDI2的表達(dá)隨著細(xì)胞從正常到轉(zhuǎn)移這一系列過程中呈現(xiàn)出先升高后降低的現(xiàn)象。表明該基因和人乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移可能都有關(guān)系。 此外，在20例腫瘤新鮮組織中，我們用半定量RT-PCR的方法初步探索了包括RhoC，CDC42，Rac2和Rac3在內(nèi)的4種Rho GTP酶的表達(dá)變化。比較了每一例病人正常和腫瘤組織中各種Rho GTP酶的表達(dá)水平的差異后，發(fā)現(xiàn)RhoC在腫瘤組織中的表達(dá)要明顯高于正常組織(87.5％)，這

9、和文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致。Rac2和CDC42的表達(dá)在我們的初步檢測中并未發(fā)現(xiàn)有明顯的規(guī)律。然而，我們發(fā)現(xiàn)Rac3在17例腫瘤組織中的表達(dá)升高非常明顯。從Rac3獲得的初步結(jié)果提示我們這個基因也許可以成為檢測腫瘤的marker和治療腫瘤的靶點之一，值得做進(jìn)一步的研究。 RAS家族是個巨大的家族，已有很多研究表明這個家族的成員和腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)。我們在搜索NCBI數(shù)據(jù)庫時發(fā)現(xiàn)了一個未被鑒定過的RAS基因RasL10B。生物信息學(xué)分

10、析提示我們該基因極可能和腫瘤抑制相關(guān)。因此我們從人白細(xì)胞cDNA文庫中分離和鑒定了這個基因，做了一些初步的功能分析，并在正常乳腺細(xì)胞株和乳腺癌細(xì)胞株中檢測和比較了RasL10B mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，RasL10B定位于染色體17q12，編碼203個氨基酸，分子量大約為23.2 kD。我們將其編碼區(qū)克隆到大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET30a中，在大腸桿菌Rosette(DE3)中表達(dá)了RasL10B蛋白質(zhì)后，用His-tag親和層析柱純

11、化得到少量純化的蛋白質(zhì)，為以后的研究做了一些材料和方法上的摸索。人的7種組織表達(dá)譜分析表明，RasL10B在這些組織中廣泛表達(dá)，但是表達(dá)量有差別，其中大腦，胰，胸腺和前列腺組織中表達(dá)較高。 COS7細(xì)胞的亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)主要定位在細(xì)胞質(zhì)中。最后，我們在人類乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，MDA-MB-468，MDA-MB-231和MDA-MB-435中和正常的乳腺細(xì)胞株HBL100中用半定量RT-PCR的方法檢測了RasL1