Cd40分子突變體在人卵巢癌中的表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、CD40分子是一個(gè)重要的協(xié)同刺激分子，可以通過增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞(APC)的抗原遞呈能力來參與免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)。由于CD40分子廣泛表達(dá)在B細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等正常組織細(xì)胞表面，同時(shí)還異常表達(dá)在一系列腫瘤和白血病細(xì)胞，以CD40為靶點(diǎn)的腫瘤抗體治療越發(fā)得到人們的重視。在本實(shí)驗(yàn)室以往的研究中，發(fā)現(xiàn)特異性表達(dá)在一些腫瘤細(xì)胞株和新鮮腫瘤細(xì)胞上的CD40突變體分子(muCD40)(CAC→CAA，78His→78Gln)，該突變位點(diǎn)位于CD40胞外段

2、的第二個(gè)富含半胱氨酸的區(qū)域，這一區(qū)域是CD40與CD40L(CD154)相互作用的重要區(qū)域，該突變使muCD40分子與CD40L的親和力明顯下降。在種系的進(jìn)化過程中，78位組氨酸高度保守，提示其對(duì)維持CD40的正常結(jié)構(gòu)和功能具有非常重要的作用。該突變體僅表達(dá)于腫瘤上而不表達(dá)于正常組織中，提示muCD40分子可能可以作為一個(gè)腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。而且該突變體是否改變了CD40正常信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，是否會(huì)異于wtCD40分子介導(dǎo)截然不同的生物學(xué)功

3、能，還有待進(jìn)一步研究。
　　 目的:檢測(cè)muCD40分子在卵巢癌細(xì)胞株中的表達(dá);分析muCD40信號(hào)激發(fā)后對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖，遷移及侵襲的影響并初步探討其信號(hào)通路機(jī)制。同時(shí)檢測(cè)人卵巢癌組織中muCD40的表達(dá)，觀察其與卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，探討其在卵巢癌中表達(dá)的意義。
　　 方法:以表達(dá)muCD40的HO8910和同時(shí)表達(dá)wtCD40/muCD40的SKOV3卵巢癌細(xì)胞株為研究對(duì)象，以抗wtCD40單克隆抗體5C11

4、及抗muCD40單克隆抗體5H6作為研究工具，流式細(xì)胞儀檢測(cè)wtCD40/muCD40分子在卵巢癌細(xì)胞上的表達(dá);細(xì)胞計(jì)數(shù)方法-8(cellcountingkit-8，CCK-8)檢測(cè)5H6或5C11刺激后對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)分析5H6作用后HO8910細(xì)胞的細(xì)胞周期的變化;共聚焦顯微鏡檢測(cè)wtCD40/muCD40在SKOV3上的表達(dá);Westernblotting檢測(cè)5H6作用后HO8910細(xì)胞中相關(guān)信號(hào)通路PI3K-A

5、KT蛋白的磷酸化;劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)wtCD40/muCD40信號(hào)在卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲過程中發(fā)揮的作用。收集卵巢癌手術(shù)切除組織54例，統(tǒng)計(jì)患者病理資料;通過免疫組織化學(xué)染色方法，分析muCD40分子在卵巢癌組織中的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:單抗5H6能夠以濃度依賴性促進(jìn)表達(dá)muCD40的HO8910細(xì)胞的增殖，且濃度為10μg/mL時(shí)5H6促增值作用最為明顯(P＜0.05);

6、單抗5H6及5C11對(duì)共表達(dá)wtCD40/muCD40的SKOV3細(xì)胞的增殖能力沒有明顯作用;單抗5H6可以使HO8910細(xì)胞的G1/G0期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增多(P＜0.05)，以10μg/mL的5H6作用最為明顯;然而共聚焦顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)5H6或5C11刺激后，wtCD40/muCD40分子在SKOV3細(xì)胞表面發(fā)生聚集現(xiàn)象，提示wtCD40/muCD40分子可能以異源三聚體的形式參與CD40信號(hào)傳導(dǎo);5H6作用后，HO8910細(xì)胞的

7、p-AKT蛋白的表達(dá)上調(diào)，在20min時(shí)尤為明顯;單抗5C11激發(fā)后可使SKOV3細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)，與對(duì)照組相比，10μg/mL.5C11激發(fā)后劃痕愈合作用明顯(P＜0.05)，而單抗5H6作用后HO8910與SKOV3細(xì)胞的遷移能力無明顯改變。同樣的，單抗5H6對(duì)兩個(gè)卵巢癌細(xì)胞株的侵襲能力均無作用，而單抗5C11可使SKOV3的侵襲能力增強(qiáng)(P＜0.05);免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，54例卵巢癌患者中，28例患者組織低表達(dá)或不表達(dá)muC

8、D40分子，占51.9％;26例患者組織高表達(dá)muCD40分子，占48.1％。muCD40在卵巢癌組織上的表達(dá)水平與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤分期以及腫瘤類型無顯著相關(guān)性，但與腫瘤分化程度密切相關(guān)。
　　 結(jié)論:抗muCD40單抗5H6可能通過PI3-AKT途徑促進(jìn)高表達(dá)muCD40的卵巢癌細(xì)胞株HO8910的增殖;而單抗5H6/5C11不能促進(jìn)wtCD40/muCD40共表達(dá)的SKOV3細(xì)胞增殖，同時(shí)發(fā)現(xiàn)wtCD40/muCD4