小麥Puroindoline A基因人工突變體的構(gòu)建、表達(dá)、抗菌活性分析及其在小麥中的功能研究.pdf

1、小麥籽粒硬度是小麥的最重要的目標(biāo)性狀之一,它直接決定小麥的磨粉品質(zhì)和烘烤品質(zhì),是小麥品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)。在控制籽粒硬度Ha位點(diǎn)的三個(gè)基因中,Puroindoline(Pina)和Puroindoline(Pinb)是主效基因,編碼相對(duì)分子量13kDa的強(qiáng)堿性蛋白——PINA和PINB蛋白。這兩種PIN蛋白同時(shí)存在于小麥胚乳和糊粉層細(xì)胞中,并結(jié)合在胚乳淀粉粒的表面,大量存在于成熟種子中。PIN蛋白還能夠有效抑制許多植物病原菌的生長,對(duì)革蘭

2、氏陰性菌,革蘭氏陽性菌以及真菌具有明顯的抗性,并且PINA蛋白的抗菌作用強(qiáng)于PINB蛋白。
　　細(xì)菌對(duì)抗抗生素的途徑主要是通過表達(dá)特定的抗性基因分解抗生素,PIN蛋白則主要通過破壞特定脂質(zhì)成分的病原菌質(zhì)膜發(fā)揮抗菌能力,因此植物抗菌蛋白有望解決病原菌抗藥性問題,具有很好的發(fā)展?jié)摿Α?br>　　成熟的PIN蛋白具有四個(gè)α-螺旋為主的二級(jí)結(jié)構(gòu),五對(duì)二硫鍵把整個(gè)分子結(jié)構(gòu)聚合成緊密的球型。前兩個(gè)α-螺旋之間存在一個(gè)含多個(gè)疏水Trp殘基和堿性

3、Lys、Asp殘基的色氨酸結(jié)構(gòu)域(TRD),很多證據(jù)證明TRD與其控制籽粒硬度和抗菌功能緊密相關(guān)。
　　本研究構(gòu)建了含多個(gè)色氨酸結(jié)構(gòu)域的Pina基因人工突變體ABBC和ABBBC,以期獲得抗菌性更強(qiáng)的植物蛋白,同時(shí)探索PIN蛋白決定籽粒硬度的分子機(jī)理;通過二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測,探索和推測PINA兩個(gè)突變蛋白的分子結(jié)構(gòu)。
　　利用PCR技術(shù),成功地?cái)U(kuò)增了小麥Pina基因并構(gòu)建了其含有不同色氨酸結(jié)構(gòu)域(TRD)的人工突變體A

4、BBC和ABBBC,并將其整合到到原核表達(dá)載體pET43.1a中,實(shí)現(xiàn)了在原核表達(dá)菌株Rosetta-gami(DE3)中的高效可溶性表達(dá)。采用Ni-NTA親和層析技術(shù),獲得了高純度和高濃度的PINA、ABBC和ABBBC重組蛋白。通過最低抑菌濃度的測定和熒光顯微鏡計(jì)數(shù)評(píng)估了重組蛋白的抗菌性變化。結(jié)果表明ABBC重組蛋白的抗菌性均明顯高于PINA重組蛋白(P<0.05),其可能成為有潛在的高效抗菌蛋白。而ABBBC重組蛋白的抗菌性均低于

5、PINA重組蛋白,無明顯的應(yīng)用價(jià)值。這一結(jié)果表明,通過增加TRD的方式可以提高PINA蛋白抗菌性,但是當(dāng)TRD數(shù)量達(dá)到3個(gè)拷貝時(shí),抗菌性能反而下降。
　　成功將Pina/ABBC/ABBBC構(gòu)建到真核表達(dá)載體pLRPT中,通過金粉包裹,基因槍轟擊,轉(zhuǎn)化入四倍體小麥Ofanto中,經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng),分化培養(yǎng),篩選培養(yǎng),春化培養(yǎng)和盆栽培養(yǎng),獲得轉(zhuǎn)基因后代。使用PCR檢測,SouthernBlot檢測,SDS-PAGE檢測以及Western