新型福壽螺纖維素酶在甲醇畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、植物纖維素是自然界中年產(chǎn)量最大的可再生能源，地球上每年光合作用生成的上億噸生物質(zhì)中，纖維素占了近一半。但是，目前自然界中的纖維素只有一小部分得到了利用。因此有效地利用這一可再生資源將其轉(zhuǎn)化為人類急需的能源、食物和化工原料，對(duì)于解決人類社會(huì)的環(huán)境污染和日益嚴(yán)峻的能源危機(jī)有著重大的現(xiàn)實(shí)意義。與酸堿處理等化學(xué)方法以及蒸爆處理等物理方法相比較，利用纖維素酶來催化水解木質(zhì)纖維素具有反應(yīng)條件溫和、無副產(chǎn)物和污染少等優(yōu)點(diǎn)，但生物質(zhì)存在水解速度慢，降解

2、不完全等缺點(diǎn)，同時(shí)由于纖維素結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，需要高效多功能纖維素酶的協(xié)同作用。 福壽螺是一類對(duì)水稻種植造成災(zāi)害的入侵生物，已有報(bào)道從其胃腸道組織中分離純化出多種纖維素酶，而相關(guān)基因的解析及克隆表達(dá)研究尚未取得很好突破，本研究以此為出發(fā)點(diǎn)，希望通過對(duì)福壽螺的纖維素酶基因的解析和克隆，及在真核系統(tǒng)的表達(dá)，進(jìn)一步揭示福壽螺纖維素酶的真面目。 本研究首先通過RT-PCR的方法從福壽螺胃中擴(kuò)增出新的纖維素酶cDNA序列―Dy13

3、00，并與克隆載體pMD 18-T相連接，通過對(duì)其全序列的分析，確定其開放閱讀框ORF長度為882bp，命名為SXYN(GenBank, AY941794)，推定的氨基酸序列含294個(gè)氨基酸，與已報(bào)道的福壽螺纖維素酶C端基因的同源性達(dá)89.8％。對(duì)該基因的分析表明，推定的氨基酸序列含有糖苷水解酶的活性位點(diǎn)及糖苷水解酶第10家族特征保守序列，但不含有明顯的纖維素結(jié)合域。對(duì)該酶糖基化位點(diǎn)的分析表明，它具有三個(gè)潛在的O-糖基化修飾位點(diǎn)。由此推

4、測所獲得的新基因可能為多種福壽螺纖維素酶中的一個(gè)，為此，進(jìn)一步將基因?qū)胝婧松铮芯科浔磉_(dá)效果和纖維素酶活。 通過PCR將目的基因cDNA兩端分別加上EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)，插入到經(jīng)過酶切處理的表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-SXYN。利用電轉(zhuǎn)化方法，將重組質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)化入酵母宿主GS115中；對(duì)在MD平板上生長出單菌落進(jìn)行G418抗性篩選，以獲得高拷貝的陽性克隆，并進(jìn)一步對(duì)獲

5、取的陽性克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證，進(jìn)行重組子的Mut＋和MutS表型鑒定；選擇其中的Mut＋型多拷貝陽性克隆進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，并以整合上線性空載體的GS115作為對(duì)照，經(jīng)酶活測定檢測到內(nèi)切葡萄糖苷酶活力，但未能檢測到木聚糖酶活力。開展了誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化工作，確定了最佳的甲醇誘導(dǎo)濃度為1.5％，最佳初始培養(yǎng)pH為6.0。與對(duì)照相比，陽性重組子的酶活是其約兩倍。通過SDS-PAGE電泳，在32kDa～36kDa的范圍內(nèi)與對(duì)照相比，有明顯的條帶，