酵母異源表達(dá)瑞氏木霉纖維素酶特性研究.pdf

1、乙醇最有發(fā)展前景的可再生液體燃料。面對(duì)世界人口的急劇膨脹和糧食短缺，用糧食生產(chǎn)酒精的發(fā)展將受到限制。近年來，利用重組酵母直接生物轉(zhuǎn)化纖維素生成酒精，由于其工藝設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低而被認(rèn)為具有良好的發(fā)展前景，并成為世界各國(guó)近年來重點(diǎn)研究的方向。
　　 酵母由于其轉(zhuǎn)化和表達(dá)的高效性是一種良好的異源表達(dá)宿主，許多來源于真菌的纖維素酶已經(jīng)被表達(dá)于釀酒酵母中，并獲得了具有活性的重組酶蛋白。然而酵母表達(dá)外源纖維素酶基因的水平非常有限，酶活也存在

2、較大幅度的下降。其中，纖維素酶系的主要組分之一Ce17A(占瑞氏木霉分泌纖維素酶60％的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，為作用于纖維素結(jié)晶區(qū)的關(guān)鍵酶)，在釀酒酵母和畢赤氏酵母中的表達(dá)被發(fā)現(xiàn)是高度糖基化的，有的沒有活性(Hong J et al.2003)，有的較野生型酶的酶活有較大程度的下降(Lynd LR et al.2002；Godbole S et al.1999；Boer H et al.2000)。而纖維素酶酶系中重要的內(nèi)切酶Ce15A，在酵母中異

3、源表達(dá)，表達(dá)量較其來源的瑞氏木霉，存在著大幅度的下降(肖志狀等2001)。
　　 本文通過瑞氏木霉纖維素外切酶Ce17A的四個(gè)N-糖基化位點(diǎn)突變子分別在畢赤氏酵母的表達(dá)，比較研究了Ce17A高糖基化對(duì)酶在酵母中表達(dá)酶活力的影響，并得到Ce17A異源表達(dá)酶活提高的突變體酶；構(gòu)建了釀酒酵母致突變菌，并將表達(dá)有瑞氏木霉纖維素內(nèi)切酶Ce15A的釀酒酵母致突變菌進(jìn)行定向篩選，得到了纖維素酶內(nèi)切酶Ce15A異源酶表達(dá)量提高的突變菌株。這不僅

4、提高了纖維素酶在酵母宿主中的異源表達(dá)的酶活和酶表達(dá)量，也為蛋白質(zhì)在酵母中的蛋白工程改造提供了有用的信息與平臺(tái)。
　　 本論文的主要研究成果如下：
　　 1. Ce17A在畢赤氏酵母中異源表達(dá)N-糖基化的研究。
　　 通過點(diǎn)突變對(duì)Ce17A的N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行改造，將45、64、270和384位四個(gè)N—糖基化位點(diǎn)的天冬酰胺突變?yōu)榻z氨酸，構(gòu)建重組質(zhì)粒并將其在p.pastoris中進(jìn)行表達(dá)，獲得單獨(dú)表達(dá)外切纖維素酶的酵

5、母菌株，以此來研究高糖基化對(duì)Ce17A在酵母表達(dá)中的影響。研究證明，Asn64位的糖基化對(duì)畢赤酵母中表達(dá)的Cel7A酶活力影響較大，此位點(diǎn)的突變使rCe17A的酶活提高了7倍。對(duì)Ce17A及其四個(gè)N一糖基化位點(diǎn)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明Asn64基本上處于蛋白內(nèi)部，殘基周圍可容納糖基化的空間很小。Asn64殘基若要被糖基化，至少會(huì)顯著改變局部結(jié)構(gòu)，甚至可能影響整體結(jié)構(gòu)和酶活。另外，rCe17A N64S突變體的酶活仍然遠(yuǎn)低于野生型，這

6、說明Asn64位的糖基化可能只是影響Ce17A在畢赤酵母中表達(dá)后活性的一個(gè)方面。蛋白質(zhì)折疊機(jī)制的差異和共翻譯糖基化對(duì)Ce17A二硫鍵和tunnel結(jié)構(gòu)的形成具有重要影響。
　　 2.致突變菌的構(gòu)建和Ce1SA高表達(dá)突變子的獲得。
　　 成功通過ctt1，sod1,Srx1三個(gè)氧化損傷清除基因的敲除，構(gòu)建了三株致突變菌株，RDKY3615(△CTT)、RDKY3615(△SOD)和RDKY3615(△SRX)，測(cè)定了致突變

7、菌的生長(zhǎng)情況和對(duì)H2O2的敏感性，并通過報(bào)告質(zhì)粒中kanamycin抗性基因的回復(fù)突變，確定了H2O2濃度和處理時(shí)間對(duì)突變率的影響。將Ce15A在致突變菌RDKY3615(△CTT)和RDKY3615(△SOD)中表達(dá)，經(jīng)雙氧水處理和大量的CMC雙層平板篩選，獲得了一系列大水解圈突變株。經(jīng)過液體發(fā)酵和上清液總酶活的測(cè)定，篩選出15株酶活較野生型明顯提高的菌株，其中RDKY3615(△CTT)-Ce15A突變株11株，RDKY3615(△