福壽螺多功能纖維素酶EGXA及其結構域在昆蟲細胞Tn5中的重組表達與性質分析.pdf

1、纖維素(Cellulose)是生物界含量最豐富的可再生性碳源。纖維素酶(Cellase)是能將纖維素轉化為葡萄糖的一系列酶的總稱。纖維素酶在降解利用纖維素作為能源物質的過程中起到關鍵性的作用，因此對纖維素酶的深入研究不僅可以豐富酶學研究的理論基礎，還具有巨大的應用價值。 從福壽螺(Ampullarm crossean)胃液中分離純化得到一種分子量為41.5KDa的多功能纖維素酶，稱為EGX，具有水解對.硝基酚纖維二糖苷(pNPC

2、)、微晶纖維素(Sigmacell)、羧甲基纖維素(CMC-Na)、Birch啪d的可溶性木聚糖(soluble xylan prepped from xylm frombirchwood)以及Oat spelt的木聚糖(xylan fom oat spelt)等5種底物的能力，即該酶是一種具有外切-β-1，4-葡聚糖酶、內切-β-1，4-葡聚糖酶和內切-β-1,4-木聚糖酶三種活力的多功能纖維素酶。根據EGX氨基酸的核心序列從福壽螺基

3、因組中克隆得到纖維酶基因egxa，長1.68Kb，結構分析表明由該基因編碼的蛋白序列EGXA具有明顯的催化結構域CD-A和結合結構域CBM-A。 昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)具有安全性高，對外源基因克隆容量大，具有完善的翻譯后加工修飾系統(tǒng)和高效表達外源基因的能力等特點，現(xiàn)已成為基因工程的四大表達系統(tǒng)(即桿狀病毒、細菌、酵母、哺乳動物細胞表達系統(tǒng))之一。昆蟲細胞在進化上與福壽螺相對而言比較接近，同時具有相似的蛋白表達加工系統(tǒng)，以及較強

4、的表達和分泌系統(tǒng)，是真核基因重組表達及性質研究的良好載體。 本實驗分別將EGXA的全長基因egxa，催化結構域基因cd-a以及結合結構域基因cbm-a在昆蟲細胞中表達，結果發(fā)現(xiàn)重組EGXA具有多種纖維素酶活力，且催化活性與野生型酶相當接近，即重組EGXA同樣具有外切-β-1，4-葡聚糖酶、內切-β-1，4-葡聚糖酶和內切-β-1，4-木聚糖酶三種活力。熒光酰肼標記染色發(fā)現(xiàn)，胞外分泌表達的EGXA被糖基化修飾，推測糖基化可能對EG

5、XA的酶活具有重要貢獻。獨立表達的結合結構域CBM-A具有結合纖維素大分子不溶性底物sigmacell的能力。而重組表達的獨立催化結構域CD-A則沒有纖維素水解活力，或者說活力很低，以至于檢測不到。 本研究成功地將福壽螺內源性纖維素酶基因egxa在真核表達系統(tǒng)--昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)中實現(xiàn)表達，這對動物纖維素酶研究來說是個重要的突破和補充?？上驳氖侵亟MEGXA具有的催化活力與野生型酶極其相似，可以作為動物纖維素酶研究的重要參