重組hBMP-2在CHO細(xì)胞中的表達(dá)、鑒定及活性分析.pdf

1、195828玎南開(kāi)人學(xué)生命科學(xué)學(xué)院碩士學(xué)位論文南開(kāi)大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本人完全了解南開(kāi)大學(xué)關(guān)于收集、保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意如下各項(xiàng)內(nèi)容：按照學(xué)校要求提交學(xué)位論文的印刷本和電子版本；學(xué)校有權(quán)保存學(xué)位論文的印刷本和電子版，并采用影印、縮印、掃描、數(shù)字化或其它手段保存論文；學(xué)校有權(quán)提供目錄檢索以及提供本學(xué)位論文全文或者部分的閱覽服務(wù)；學(xué)校有權(quán)按有關(guān)規(guī)定向國(guó)家有關(guān)部門或者機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版；在不以贏利為目的的前提下，學(xué)校

2、可以適當(dāng)復(fù)制論文的部分或全部?jī)?nèi)容用于學(xué)術(shù)活動(dòng)。學(xué)位論文作者簽名：侈遭豐∥口‘年pr月研日經(jīng)指導(dǎo)教師同意，本學(xué)位論文屬于保密，在r年解密后適用本授權(quán)書(shū)。指導(dǎo)教師簽名：E∑)娣學(xué)位論文作者簽名：滲眸么二天分解密時(shí)間：≯口，f年I二月’歲1日各密級(jí)的最長(zhǎng)保密年限及書(shū)寫(xiě)格式規(guī)定如下：內(nèi)部5年(最長(zhǎng)5年，可少于5年)秘密★lO年(最長(zhǎng)10年，可少于10年)機(jī)密★20年(最長(zhǎng)20年，可少于20年)中文摘要重組hBMP2在CHO細(xì)胞中的表達(dá)、鑒定及活

3、性分析中文摘要BMPs(Bonemorphogenticprote。in，BMP)屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transformationgrowthfactor，TGF)B超家族，BMPs最早是從骨中提取得到，能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)異位骨和軟骨形成，迄今為止，已經(jīng)有40多個(gè)BMPs基因相繼被克隆。許多BMPs的體外(invitro)和體內(nèi)(invivo)實(shí)驗(yàn)表明BMPs具有調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)異位骨形成，促進(jìn)骨折愈合，及具有控制哺乳動(dòng)物

4、骨骼不同形態(tài)特征形成的功能。BMP2是BMP家族中的重要一員，其高效的誘導(dǎo)成骨活性已經(jīng)在臨床前以及臨床實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，顯示了在治療難愈性骨折治療，骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防，脊柱融合術(shù)，牙齒工程等眾多臨床應(yīng)用中的巨大潛力。本研究采用基因工程的方法，在體外表達(dá)重組入骨形態(tài)發(fā)生蛋白2。研究中，我們采用RTPCR、cDNA克隆、真核表達(dá)載體構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的克隆、WesternBlot等生物學(xué)技術(shù)與方法，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)rhBMP2蛋

5、白，篩選穩(wěn)定、高效表達(dá)rhBMP2的重組CHO細(xì)胞系?，F(xiàn)將已完成的工作報(bào)告如下：1rhBMP2真核表達(dá)載體的構(gòu)建以本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的含有hBMP2cDNA全長(zhǎng)序列(GenBankaccessionNoNM001200)的質(zhì)粒pCDNA6AhBMP2為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到hBMP2的cDNA全長(zhǎng)序列，并將其連接至表達(dá)載體質(zhì)粒pCDNA31()中，構(gòu)建了hBMP一2的真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA31()hBMP2，用其轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞叵col

6、iDH5Q，采用菌落PCR的方法篩選陽(yáng)性菌落，并進(jìn)一步提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切鑒定，鑒定結(jié)果與預(yù)期吻合，測(cè)序結(jié)果表明讀碼框完全J下確。2構(gòu)建穩(wěn)定、高效表達(dá)rhBMP2的CHO細(xì)胞系將真核表達(dá)載體pCDNA31()hBMP2與篩選標(biāo)記載體pSV2dhfr以l：5(摩爾比)混合，利用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染CHO(dhfr)細(xì)胞。G418及dhfr雙抗性篩選3周后，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hBMP2和空載的細(xì)胞系，利用MTX擴(kuò)增系統(tǒng)大量擴(kuò)增hBMP2基因在宿主染色