hBMP-2基因聯(lián)合鹿瓜多肽對(duì)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)及分泌功能影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的：
　　 當(dāng)今軟骨組織工程和基因治療已成為骨關(guān)節(jié)炎軟骨修復(fù)治療的研究熱點(diǎn),其中如何獲得大量有功能的軟骨種子細(xì)胞已成為制約組織工程構(gòu)建軟骨的瓶頸。本實(shí)驗(yàn)研究將hBMP-2基因體外轉(zhuǎn)染兔軟骨細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染體系中加入鹿瓜多肽聯(lián)合培養(yǎng),觀察二者對(duì)軟骨細(xì)胞增殖及分泌Ⅱ型膠原功能的影響,試圖為獲得大量功能良好的軟骨種子細(xì)胞尋找新的方向,也為hBMP-2基因和鹿瓜多肽注射液用于臨床治療骨、軟骨破壞性疾病進(jìn)一步提供理論依據(jù)。
　　

2、 方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)分組:未轉(zhuǎn)染組、空病毒(Ad-GFP)組、Ad-hBMP-2-GFP組、鹿瓜多肽+Ad-hBMP-2-GFP組
　　 2.人胚腎293細(xì)胞包裝hBMP-2-GFP腺病毒載體,病毒擴(kuò)增及病毒滴度測(cè)定。
　　 3.分離培養(yǎng)、鑒定原代兔軟骨細(xì)胞,用第三代細(xì)胞為模型,通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù),轉(zhuǎn)染hBMP-2至兔軟骨細(xì)胞48h后,用RT-PCR檢測(cè)hBMP-2 mRNA的表達(dá),細(xì)胞免疫熒光法和Weste

3、rn-Blot檢測(cè)軟骨細(xì)胞中hBMP-2蛋白的表達(dá)和Ⅱ型膠原的表達(dá),用未轉(zhuǎn)染組和空病毒(Ad-GFP)組做對(duì)照。
　　 4.鹿瓜多肽作用于軟骨細(xì)胞24h、48h、72h后,用MTT法篩選最佳藥物濃度和時(shí)間。
　　 5.培養(yǎng)48h后,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)周期;培養(yǎng)48h、72h后,MTT法檢測(cè)軟骨細(xì)胞的增殖,Western blot檢測(cè)hBMP-2蛋白和Ⅱ型膠原的表達(dá)。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS1

4、6.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示((x)±s),采用單因素方差分析,組間差異比較用q檢驗(yàn),P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過(guò)感染293細(xì)胞后,測(cè)得Ad-hBMP2-GFP滴度為2×106PFU/ml。
　　 2.轉(zhuǎn)染48h后,hBMP-2基因轉(zhuǎn)染組可見(jiàn)hBMP-2mRNA表達(dá),細(xì)胞胞漿可見(jiàn)紅色熒光表達(dá),胞核無(wú)表達(dá),未轉(zhuǎn)染組和空病毒組呈陰性，轉(zhuǎn)染48h、72h后,比較hB

5、MP-2蛋白和Ⅱ型膠原的表達(dá)量,hBMP-2轉(zhuǎn)染組較空病毒轉(zhuǎn)染組灰度值增加。
　　 3.鹿瓜多肽4～32ug/ml濃度作用于軟骨細(xì)胞24h～72h時(shí)具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖作用,以8ug/ml作用48h后作用最明顯。
　　 4.hBMP-2基因聯(lián)合鹿瓜多肽作用于軟骨細(xì)胞48h后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)周期結(jié)果發(fā)現(xiàn),二者能使軟骨細(xì)胞進(jìn)入S-G2/M期細(xì)胞比例增加;促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖;使軟骨細(xì)胞hBMP-2蛋白表達(dá)和Ⅱ型膠原分