淫羊藿甙對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖、分泌及MAPKs通路的影響.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨類疾病作為一類嚴(yán)重影響動(dòng)物及人類健康的疾病，成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)、科學(xué)及社會普遍關(guān)注的問題。這類疾病的發(fā)生發(fā)展主要是由于各種致病因子作用于機(jī)體，導(dǎo)致軟骨組織損傷所致，但因?yàn)殛P(guān)節(jié)部位的特殊解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，使得當(dāng)前預(yù)防和治療該病較為棘手。淫羊藿甙作為淫羊藿的主要單體之一，現(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其能夠通過激活細(xì)胞MAPKs通路而促進(jìn)成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞的增殖、分化，抑制細(xì)胞凋亡，從而對骨損傷具有著明顯的改善作用。但淫羊藿甙對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的作用及作用機(jī)制尚

2、完全清楚，因此本試驗(yàn)借助細(xì)胞培養(yǎng)、組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞儀等技術(shù)來研究淫羊藿甙對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖、凋亡及NO/NOS、MMP-13分泌的影響。同時(shí)運(yùn)用Western-Blot技術(shù)探究淫羊藿甙對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞MAPKs通路的作用及調(diào)控機(jī)理，從而為臨床應(yīng)用淫羊藿甙防治軟骨細(xì)胞類疾病提供相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。
　　 本試驗(yàn)以健康豬的膝關(guān)節(jié)為材料，利用酶消化法分離培養(yǎng)了豬的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，建立了豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的高效體外培養(yǎng)方法。同時(shí)利用細(xì)

3、胞學(xué)、HE染色、Ⅱ型膠原免疫組化及超微結(jié)構(gòu)觀察等方法對分離培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)采用酶消化法分離培養(yǎng)的細(xì)胞長勢良好，形態(tài)、密度正常，可用于本試驗(yàn)的研究工作。
　　 MTT法檢測淫羊藿甙對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的作用發(fā)現(xiàn):終濃度為1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL和40ng/mL的淫羊藿甙對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖均有促進(jìn)作用。但隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加(1d、3d、5d、7d)，各濃度淫羊藿甙對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用也有所變

4、化:低、中濃度淫羊藿甙的促進(jìn)作用越來越顯著(P＜0.05)，而高濃度的促進(jìn)作用較之下降。在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞整個(gè)生長曲線上，濃度為10ng/mL的淫羊藿甙對其增殖有較好的促進(jìn)作用，因此本試驗(yàn)就以終濃度為10 ng/mL的淫羊藿甙作為對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的最適濃度進(jìn)行后續(xù)研究。
　　 終濃度為10ng/mL的淫羊藿甙作用于關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡的結(jié)果顯示:作用1d時(shí)可引起細(xì)胞G1期阻滯(P＜0.05)，但加入淫羊藿甙3d、

5、5d、7d的細(xì)胞，周期無明顯變化(P＞0.05);而淫羊藿甙對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡無明顯作用(P＞0.05)，因此認(rèn)為淫羊藿甙有利于關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的生長增殖。
　　 利用比色法檢測NO/NOS的結(jié)果發(fā)現(xiàn):關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在終濃度為10ng/mL的淫羊藿甙作用5d時(shí)，NO和NOS的分泌顯著減少(P＜0.05);利用ELISA方法檢測MMP-13發(fā)現(xiàn):作用3d、5d、7d時(shí)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌MMP-13顯著下降(P＜0.05)，由此表明淫羊藿

6、甙可以明顯調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞多種分解因子的分泌。
　　 Western-blot試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):終濃度為10ng/mL的淫羊藿甙加入關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)1d、3d、5d、7d，各試驗(yàn)組分別在培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束前5min、25min、1.5h加入淫羊藿甙后ERK1/2通路磷酸化蛋白水平無顯著差異(P＞0.05)，但在5min和25min時(shí)試驗(yàn)組的ERK1/2通路磷酸化蛋白水平顯著高于對照組(P＜0.05)，說明淫羊藿甙加入1d～7d ERK1/

7、2通路磷酸化蛋白的表達(dá)無明顯變化，且可以在短時(shí)間之內(nèi)(5min)快速激活通路并維持通路的激活狀態(tài)達(dá)1.5h。此外淫羊藿甙對p38通路的激活作用不如激活ERK1/2通路快速，25min后才達(dá)到激活高峰，且維持時(shí)間也較短，1.5h磷酸化蛋白表達(dá)水平已顯著低于25min的表達(dá)水平(P＜0.01)。因此認(rèn)為淫羊藿甙作用于關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞時(shí)能在短時(shí)間內(nèi)激活MAPKs通路并維持其激活狀態(tài)，且對ERK1/2通路的激活速度要快于對p38通路。