川芎嗪治療膝骨性關節(jié)炎的臨床觀察及對兔關節(jié)軟骨細胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　 1、觀察川芎嗪治療瘀血阻絡型膝骨性關節(jié)炎的臨床療效，為川芎嗪應用于骨性關節(jié)炎的防治提供臨床資料。
　　 2、探討川芎嗪對兔軟骨細胞增殖與凋亡影響及其作用機制，從分子生物學水平闡明川芎嗪保護關節(jié)軟骨的部分機理。
　　 方法：
　　 1、選擇臨床瘀血阻絡型膝骨性關節(jié)炎患者76例（102個膝），用抽簽法隨機分為治療組38例（52個膝）與對照組38例（50個膝）。治療組于患側膝關節(jié)腔內注射川芎嗪注射

2、液，每次2ml，每周1次，連續(xù)5周為1個療程。對照組于患側膝關節(jié)腔內注射玻璃酸鈉注射液，每次2ml，每周1次，連續(xù)5周為1個療程。觀察治療前后患者的臨床療效、關節(jié)癥狀總積分、關節(jié)液中IL-1、IL-6、TNF-α、MMP-3含量變化。
　　 2、4周齡雄性新西蘭大白兔16只，取膝關節(jié)軟骨建立體外培養(yǎng)的軟骨細胞體系，甲苯胺藍染色鑒定軟骨細胞，熒光倒置相差顯微鏡觀察軟骨細胞的形態(tài)結構;MTT檢測第2至5代軟骨細胞的增長曲線。

3、　　 3、第3代軟骨細胞同步化，抽簽法隨機分為對照組(川芎嗪終濃度0 ug/L的10％FBS DMEM)、中劑量組(川芎嗪終濃度50 ug/L的10％FBS DMEM)，分別培養(yǎng)24h、48h、72h、96h，MTT檢測軟骨細胞的活性，確定川芎嗪的有效干預時間。第3代軟骨細胞同步化，抽簽法隨機分為對照組(川芎嗪終濃度0 ug/L的10％FBS DMEM)、低劑量組(川芎嗪終濃度25 ug/L的10％FBSDMEM)、中劑量組(川芎嗪終

4、濃度50 ug/L的10％FBS DMEM)、高劑量組(川芎嗪終濃度100 ug/L的10％FBS DMEM)，各組干預72h后，透射電子顯微鏡觀察軟骨細胞的形態(tài)結構，流式細胞儀檢測軟骨細胞周期分布，RT-PCR檢測軟骨細胞CyclinD1、CDK4、p21mRNA表達，Western-Blot檢測軟骨細胞CyclinD1、CDK4、p21蛋白表達。
　　 4、第3代軟骨細胞培養(yǎng)72h，加入含SNP終濃度為1mmol/L的10％

5、FBS DMEM干預24h復制軟骨細胞凋亡模型，細胞分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組;并設正常組，加入10％FBS DMEM，分組進行干預12h、24h、36h，MTT檢測軟骨細胞的活性，確定川芎嗪的有效干預時間。第3代軟骨細胞培養(yǎng)72h，正常組加入10％FBS DMEM，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組加入含SNP終濃度為1mmol/L的10％FBS DMEM干預24h后，各組再加相應藥物干預24h，MTT法檢測軟骨細胞活

6、性，透射電子顯微鏡觀察軟骨細胞的形態(tài)結構，流式細胞儀檢測軟骨細胞的凋亡，RT-PCR檢測軟骨細胞Bcl-2、Bax mRNA表達，Western-Blot檢測軟骨細胞Bcl-2、Bax蛋白表達，比色法檢測軟骨細胞Caspase-3、Caspase-9蛋白的活性。
　　 結果：
　　 1、川芎嗪治療瘀血阻絡型膝骨性關節(jié)炎的臨床研究:76例（102個膝）患者，完成治療73例（99個膝），其中，治療組剔除1例（1個膝），對照組

7、剔除2例（2個膝）。兩組治療后臨床優(yōu)良率、有效率比較無顯著性差異（P＞0.05）。治療后兩組癥狀積分前后分值差異比較，治療組雖低于對照組，但無顯著性差異(P＞0.05）。與治療前比較，兩組IL-1、IL-6、TNF-α、MMP-3含量均明顯降低（P＜0.05);治療后兩組降低程度比較，各指標雖有差異，但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)
　　 2、原代、第2代、第3代軟骨細胞生長狀況良好，甲苯胺藍染色后，胞漿內見紫紅色異染顆粒。增殖曲

8、線上，第2、3代軟骨細胞生長旺盛，活性比第4、5代軟骨細胞高，尤其是第3代軟骨細胞;第3代軟骨細胞，第3天增殖開始加速，第4天進入指數(shù)生長期，第5、6天增殖速度逐漸減慢。
　　 3、川芎嗪促進軟骨細胞增殖的研究:
　　 (1)川芎嗪促進軟骨細胞增殖的有效作用時間為72h。中劑量組干預72h細胞OD值明顯高于干預24h、48h、96h（P＜0.05）。
　　 (2)透射電子顯微鏡觀察軟骨細胞的形態(tài)結構:干預72h后

9、各組細胞呈圓形、橢圓形、多角形，核呈圓形為主，可見分葉狀、不規(guī)則，染色質分布均勻，核仁清晰，中劑量組可見胞質中粗面內質網(wǎng)豐富擴張，高劑量組可見細胞核的分裂。
　　 (3)軟骨細胞的周期分布:干預72h，中劑量組、高劑量組G0/G1期顯著低于對照組同期（P＜0.01)，G2/M期明顯高于對照組同期、低劑量組（P＜0.05），PI明顯高于對照組同期（P＜0.05）。
　　 (4)軟骨細胞CyclinD1、CDK4 mRNA表

10、達，干預72h，中劑量組、高劑量組明顯高于對照組、低劑量組（P＜0.05）;軟骨細胞p21 mRNA表達，干預72h，中劑量組、高劑量組明顯低于對照組（P＜0.05）。
　　 (5)軟骨細胞CyclinD1、CDK4蛋白表達，干預72h，中劑量組、高劑量組明顯高于對照組、低劑量組（P＜0.05）;軟骨細胞p21蛋白表達，中劑量組、高劑量組明顯低于對照組、低劑量組（P＜0.05）。
　　 4、川芎嗪抑制軟骨細胞凋亡的研究:

11、
　　 (1)川芎嗪抑制軟骨細胞凋亡的有效作用時間為24h;干預24h后，軟骨細胞OD值，中劑量組、高劑量組明顯高于模型組（P＜0.05)。
　　 (2)透射電子顯微鏡觀察軟骨細胞的形態(tài)結構:干預24h，模型組可見大量碎裂的壞死、凋亡的軟骨細胞;低劑量組見較多碎裂、凋亡的軟骨細胞;中劑量組、高劑量組見少量壞死、凋亡的軟骨細胞。
　　 (3)軟骨細胞的總凋亡率:模型組(54.30±1.58)％，低劑量組(27.00

12、±3.24)％，中劑量組(19.09±3.33)％，高劑量組(16.22±2.59)％，中劑量組、高劑量組明顯低于模型組、低劑量組(P＜0.05)。
　　 (4)軟骨細胞Bax mRNA表達，中劑量組、高劑量組明顯低于模型組（P＜0.05）;軟骨細胞Bcl-2 mRNA表達，中劑量組、高劑量組明顯高于模型組(P＜0.05)。
　　 (5)軟骨細胞Bax蛋白的表達，中劑量組、高劑量組明顯低于模型組（P＜0.05）;軟骨細胞

13、Bc(l)-2蛋白的表達，中劑量組、高劑量組明顯高于模型組（P＜0.05）。
　　 (6)軟骨細胞Caspase-3、Caspase-9蛋白活性，中劑量組、高劑量組顯著低于模型組（P＜0.01)，中劑量組、高劑量明顯低于低劑量組(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 1、川芎嗪關節(jié)腔注射治療能有效緩解瘀血阻絡型膝骨性關節(jié)炎患者的臨床癥狀，降低關節(jié)液中IL-1、IL-6、TNF-α、MMP-3的含量，是治療膝骨性關

14、節(jié)炎的有效方法之一。
　　 2、川芎嗪能促進軟骨細胞增殖。其作用機制可能通過上調軟骨細胞周期正向調節(jié)因子CyclinD1、CDK4表達，下調負向調節(jié)因子p21表達，加速軟骨細胞周期關鍵限制點G1/S期的切換，促進軟骨細胞周期的進程。
　　 3、川芎嗪能抑制軟骨細胞凋亡。其作用機制可能通過下調軟骨細胞促凋亡因子Bax、Caspase-3、Caspase-9的表達，上調抗凋亡因子Bcl-2表達，抑制軟骨細胞線粒體凋亡通路的信