基于IL-1β-MAPKs通路探討威靈仙總皂苷對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　建立兔膝骨關(guān)節(jié)炎(OA)動物模型及軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，觀察威靈仙總皂苷（TSC）對軟骨細(xì)胞凋亡的影響，探討 TSC通過 IL-1β/MAPKs信號通路干預(yù)兔膝OA軟骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　方法：
　　1、TSC對兔膝OA IL-1β/MAPKs信號通路及軟骨細(xì)胞凋亡影響的在體實驗
　　健康雄性新西蘭大白兔48只，隨機(jī)分為兩組：空白組及模型組，每組分別有兔8只、40只，模型組采取石膏管型固定（左后肢膝

2、關(guān)節(jié)伸直位）造模，造模成功后，模型組兔隨機(jī)分為5組：模型對照組，TSC低劑量組、TSC中劑量組、TSC高劑量組及塞來昔布組，每組8只?？瞻捉M及模型對照組，每日抽取10毫升生理鹽水灌胃，TSC低、中、高劑量組分別按25mg/Kg/d、50mg/Kg/d.100mg/Kg/d灌胃，塞來昔布組每日灌胃劑量為10mg/Kg。6周后處死動物，取膝關(guān)節(jié)軟骨多聚甲醛固定、石蠟包埋，HE染色觀察軟骨組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，ELISA法檢測軟骨組織內(nèi)IL-1β的

3、濃度。RT-PCR法檢測軟骨組織內(nèi)Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9的基因表達(dá)。Western-blot法檢測軟骨組織p-P38、p-ERK-1及p-ERK-2蛋白表達(dá)。
　　2、TSC對IL-1β作用下軟骨細(xì)胞凋亡及MAPKs信號通路影響的離體實驗
　?。?）健康4周齡新西蘭大白兔20只，取膝關(guān)節(jié)軟骨組織，建立兔膝軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，甲苯胺藍(lán)染色法鑒定軟骨細(xì)胞，顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)。

4、　?。?）取第3代軟骨細(xì)胞，隨機(jī)分為正常組，IL-1β組、IL-1β+TSC組1（TSC濃度為25μg/mL）、IL-1β+TSC組2（TSC濃度為50μg/mL）、IL-1β+TSC組3（TSC濃度為100μg/mL）、IL-1β+TSC組4（TSC濃度為200μg/mL）、IL-1β+TSC組5(TSC濃度為400μg/mL)，各組IL-1β濃度均為10ng/mL，分別干預(yù)24h、48h，72h、96h后，MTT法檢測軟骨細(xì)胞的活性

5、，篩選TSC對IL-1β作用下的軟骨細(xì)胞最佳干預(yù)濃度和時間。
　?。?）選取第3代軟骨細(xì)胞，隨機(jī)分為空白組、IL-1β組（10ng/mL）、IL-1β+TSC組（IL-1β濃度為10ng/mL、TSC濃度為MTT法確定的最佳干預(yù)濃度），依確定的最佳干預(yù)時間干預(yù)后，收集軟骨細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測軟骨細(xì)胞凋亡。RT-PCR法檢測軟骨細(xì)胞 Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9的基因表達(dá)。Western-blot法檢測

6、各組軟骨細(xì)胞 p-P38、p-ERK-1及p-ERK-2蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、TSC對兔膝OAIL-1β/MAPKs信號通路及軟骨細(xì)胞凋亡影響的在體實驗
　?。?）模型組動物X片示，關(guān)節(jié)間隙不對稱，關(guān)節(jié)間隙狹窄，關(guān)節(jié)面不光整，關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)硬化，有骨贅形成，造模成功。干預(yù)6周后，HE染色結(jié)果表明不同濃度的TSC和塞來昔布均可以明顯促進(jìn)膝OA軟骨組織的修復(fù)，TSC高劑量組效果最佳；各組軟骨組織內(nèi)IL-1β的水

7、平，模型對照組明顯高于空白組IL-1β水平（P＜0.05），TSC低劑量組、TSC中劑量組及TSC高劑量組明顯低于模型對照組（P＜0.05），隨著TSC濃度增加，IL-1β的水平逐漸降低，TSC高劑量組IL-1β水平明顯低于塞來昔布組（P＜0.05）。
　?。?）干預(yù)6周后，各組軟骨組織內(nèi)Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9 mRNA表達(dá)：Bcl-2 mRNA，模型對照組明顯低于空白組（P＜0.05），TSC

8、低劑量組、TSC中劑量組及TSC高劑量組明顯高于模型對照組（P＜0.05）， TSC中劑量組明顯高于TSC低劑量組（P＜0.05），TSC高劑量組明顯高于TSC中劑量組（P＜0.05），塞來昔布組明顯低于TSC高劑量組（P＜0.05）；Bax mRNA表達(dá)，模型對照組明顯高于空白組（P＜0.05），TSC低、中劑量組與模型對照組比較沒有顯著性差異（P＞0.05），TSC高劑量組及塞來昔布組明顯低于模型對照組（P＜0.05），TSC高劑量

9、組與塞來昔布組比較無顯著性差異（P＞0.05）；Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)，模型對照組明顯高于空白組（P＜0.05），TSC低劑量組、TSC中劑量組、TSC高劑量組、塞來昔布組均明顯低于模型對照組（P＜0.05）；Caspase-3 mRNA表達(dá),TSC低劑量組、TSC中劑量組、塞來昔布量組之間無明顯差異（P＞0.05），但 TSC高劑量組明顯低于 TSC低、中劑量組及塞來昔布組；caspase-9 mRNA表

10、達(dá)，TSC低劑量組、TSC中劑量組、TSC高劑量組之間有明顯差異（P＜0.05），TSC高劑量組與塞來昔布組比較無明顯差異（P＞0.05）。
　?。?）干預(yù)6周后，各組軟骨組織內(nèi)p-P38、p-ERK-1及p-ERK-2蛋白表達(dá)：p-P38、p-ERK-1及p-ERK-2蛋白表達(dá)，模型對照組明顯高于空白組（P＜0.05）；TSC低劑量組、TSC中劑量組、TSC高劑量組及塞來昔布組明顯低于模型對照組，其中尤以TSC高劑量組最低（P＜

11、0.05）；隨著TSC濃度的不斷增加，p-ERK-1、p-ERK-2蛋白表達(dá)均逐漸減低，而且各組之間均有明顯不同（P＜0.05）；p-P38蛋白表達(dá)，TSC中劑量組和TSC低劑量組無明顯差異（P＞0.05），TSC高劑量組顯低于TSC中劑量組（P＜0.05）。
　　2、TSC對IL-1β作用下軟骨細(xì)胞凋亡及MAPKs信號通路影響的離體實驗
　　（1）第一代、第二代、第三代軟骨細(xì)胞生長良好，原代軟骨細(xì)胞經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，軟骨細(xì)

12、胞呈異染性。
　?。?）MTT法篩選TSC對IL-1β作用下兔第3代軟骨細(xì)胞干預(yù)的最佳濃度為200μg/mL，最佳干預(yù)時間為72小時。
　?。?）各組軟骨細(xì)胞凋亡率：IL-1β組明顯高于空白組軟骨細(xì)胞凋亡率（P＜0.05），IL-1β+TSC組明顯低于IL-1β組（P＜0.05）。
　　（4）各組第三代軟骨細(xì)胞干預(yù)72小時后 Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)：Bcl-2mRNA表

13、達(dá)，IL-1β組明顯低于空白組（P＜0.05），IL-1β+TSC組明顯高于IL-1β組（P＜0.05）；Bax、Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)，IL-1β組明顯高于空白組（P＜0.05），IL-1β+TSC組明顯低于IL-1β組（P＜0.05）。
　?。?）各組第3代軟骨細(xì)胞干預(yù)72小時后p-ERK-1、 p-ERK-2、p-P38蛋白表達(dá):IL-1β組明顯均高于空白組（P＜0.05），IL-1β+TSC組

14、明顯低于IL-1β組（P＜0.05）
　　結(jié)論：
　　1、體內(nèi)外研究表明，上游IL-1β/MAPKs信號通路的高度活化，下游Caspase-3、Caspase-9的高表達(dá)，促凋亡因子Bax的高表達(dá)、抗凋亡因子Bcl-2的低表達(dá)，是OA的發(fā)生發(fā)展、軟骨細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制之一。
　　2、體內(nèi)外研究表明，TSC可以延緩軟骨組織退變，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，并對其上游IL-1β/MAPKs通路，下游Caspase-3、Caspase