β-catenin對大鼠髖脫位關節(jié)軟骨細胞增殖和凋亡影響的實驗研究.pdf

1、[背景和目的]：
　　發(fā)育性髖關節(jié)脫位(Developmental dislocation of the hip，DDH)是小兒矯形外科最常見的疾病之一，由于早期篩查工作的開展，大部分患兒能獲得及時的治療，但仍有部分患兒在治療過程中出現(xiàn)再脫位、殘余髖發(fā)育不良(Residual acetabularDysplasia RAD)，以致成年后早期出現(xiàn)退行性骨關節(jié)炎(Osteoarthritis OA)，最終進行全髖關節(jié)置換（Total

2、hip arthroplasty，THA），降低了他們的生活質量。骨關節(jié)炎的實質是關節(jié)軟骨發(fā)生退變，一般主要包括兩方面，一方面細胞外基質的合成和降解代謝失衡;另一方面軟骨細胞的增殖和凋亡發(fā)生變化。目前對于DDH早期發(fā)生關節(jié)軟骨退行性變的細胞和分子機制仍不清楚。近來有研究表明β-catenin介導的Wnt通路在關節(jié)軟骨的發(fā)育、增殖、分化、凋亡以及維持內環(huán)境的穩(wěn)定等方面起著關鍵作用。本課題組在前期實驗研究發(fā)現(xiàn)β-catenin對關節(jié)軟骨起著

3、雙向調節(jié)的作用，主要表現(xiàn)對于正常軟骨在早期關節(jié)發(fā)育階段，β-catenin主要是激活促進關節(jié)軟骨分化成熟，軟骨發(fā)育成熟后β-catenin表達迅速降低;但在髖脫位關節(jié)軟骨中隨著發(fā)育成熟β-catenin的表達繼續(xù)升高，促進了關節(jié)軟骨發(fā)生退行性改變，推測關節(jié)軟骨發(fā)生退變可能與β-catenin激活后導致X型膠原(Col X)以及基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase MMPs）的表達上調有關。正常情況下，軟骨細胞

4、是軟骨組織內唯一的細胞類型，它在軟骨基質損傷及重塑過程中對維持內環(huán)境的穩(wěn)定起著重要作用，但在關節(jié)軟骨退變過程中β-catenin對軟骨細胞的增殖、凋亡的調控尚未見相關報道。因此，本文擬通過動物實驗來模擬髖脫位的自然進程，探討關節(jié)軟骨在退變過程中β-catenin對軟骨細胞增殖和凋亡的調控作用，為進一步深入研究DDH發(fā)生退變的分子機制提供新思路。
　　[方法]：
　　1.60只新生Wistar大鼠隨機分成實驗組(n=30)和對

5、照組(n=30)，雌雄不限，體重均等。并按鼠齡分為2周齡組(n=10)、4周齡組(n=10)、8周齡組(n=10)，對照組按照類似方法進行分組。實驗組大鼠模擬襁褓體位采用醫(yī)用膠帶對雙髖雙膝伸直并攏固定10天制作髖脫位動物模型，然后去除外固定后繼續(xù)飼養(yǎng)。每組達到預期時間進行取材進行實驗。其中一側髖關節(jié)經(jīng)過固定、脫鈣從冠狀面剖開拍照存檔用于測量臼深指數(shù)以及股骨頭形態(tài)指數(shù)，然后制成切片進行番紅O-固綠染色和β-catenin免疫組化染色，高倍

6、鏡下隨機取五個不同視野觀察組織形態(tài)變化以及β-catenin在不同時段關節(jié)軟骨中的表達，并進行Mankin評分評估軟骨退變程度。
　　2.另一側髖關節(jié)用于提取關節(jié)軟骨細胞進行原代培養(yǎng)，Ⅱ型膠原免疫熒光及甲苯胺藍染色鑒定，采用CCK-8、流式分析細胞周期，檢測兩組在不同時段的增殖能力與凋亡情況;
　　3.對8周齡對照組貼壁軟骨細胞進行LiCl干預，激活β-catenin表達，免疫熒光檢測β-catenin;重復CCK-8、流式

7、細胞分析檢測軟骨細胞的增殖能力、細胞周期以及凋亡的改變;TUNEL免疫熒光法檢測凋亡率。
　　4.所有體外細胞實驗均重復三次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(X±SD)表示。采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，t榆驗進行統(tǒng)計學分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　[結果]：
　　1、動物模型制作以及大體形態(tài)觀察:
　　實驗過程中，2周齡組松脫一只予以剔除，死亡一只。去除外固定后同籠喂養(yǎng)，大鼠體重與身長與對照組相比

8、無明顯差異。實驗組的大體標本均可見股骨頭脫出于髖臼外，證實建模成功（建模成功率93.3％）;且隨著生長發(fā)育，股骨頭未能獲得復位，關節(jié)囊增厚，髖臼口變小，臼內有軟組織嵌入，股骨頭明顯扁平，與髖臼嚴重不匹配。盡管實驗組臼深指數(shù)以及股骨頭形態(tài)指數(shù)顯示較對照組發(fā)育小，但隨鼠齡增加仍呈發(fā)育增大趨勢;8周齡時髖臼發(fā)育基本停止，頭臼不對稱進一步加重(P＜0.05)。
　　2、病理組織形態(tài)觀察以及Mankin評分:
　　番紅/固綠染色可見到

9、對照組隨著生長發(fā)育，關節(jié)軟骨形態(tài)呈球形，且軟骨層次清楚，逐漸變薄;實驗組在4周齡關節(jié)軟骨變形明顯，淺層部分染色變淺，出現(xiàn)軟骨細胞排列紊亂，局部聚集成簇、纖維化，8周齡時番紅失染范圍擴大，淺層軟骨細胞消失，殘留陷窩，可見較多裂隙，移行層細胞明顯增生成簇。Mankin評分在2周齡時兩組沒有顯著差異(P＞0.05)，4、8周齡時實驗組顯著高于對照組(P=0.000)，且實驗組成逐漸上升趨勢。β-catenin:免疫組織化學中可見β-caten

10、in在對照組大鼠2周時表達較多，4周時表達明顯增加，隨鼠齡增長表達逐漸下降，8周時表達很弱;而在實驗組β-catenin表達無下降趨勢，且隨著生長發(fā)育持續(xù)高表達。
　　3、體外細胞培養(yǎng)形態(tài)以及鑒定:
　　軟骨細胞培養(yǎng)及鑒定:軟骨細胞培養(yǎng)后Ⅱ型膠原免疫熒光及甲苯胺藍染色鑒定為軟骨細胞。
　　4、不同時段軟骨細胞增殖和凋亡的改變
　　增殖速率在2周齡時:實驗組(0.86)比對照組(0.75)快15.1％;4周齡時:實

11、驗組(1.14)比對照組(0.92)快24.6％;8周:實驗組(0.78)比對照組(0.64)快21.8％。
　　增殖指數(shù):2周:對照組為30.4％，實驗組44.9％，兩者相比有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01);4周:對照組為33.7％，實驗組38.4％，兩者之間有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）;8周:對照組為22.4％，實驗組26.4％，兩者之間有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　凋亡率:2周:對照組22.1％，實驗組55.1％

12、，顯著高于對照組（P＜0.01）。4周:對照組0.91％，實驗組1.02％，兩者之間無顯著統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。8閏:對照組0.75％，實驗組49.1％，顯著高于對照組(P＜0.01)。
　　5、LiCl干預后軟骨細胞增殖和凋亡的改變。
　　LiCl激活β-catenin表達:8周齡正常貼壁軟骨細胞加入LiCl后免疫熒光可見胞漿以及核內β-catenin表達明顯增高，且以胞核內增多為主。
　　干預后增殖速率(0.

13、58)比干預前正常軟骨細胞的增殖速率(0.64)下降了9％;與8周實驗組增殖速率(0.78)相比，明顯下降約25.6％。
　　LiCl干預后增殖指數(shù)從22.4％下降至18.5％，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);并明顯低于8周實驗組26.4％，有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01);
　　LiCl干預后凋亡率從0.75％上升至33.1％，有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，但是顯著低于8周實驗組(49.1％ P＜0.01)。