sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白在CHO細(xì)胞中的表達(dá)、制備及生物學(xué)功能鑒定.pdf

1、目的：
　　為了增加可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ與TNFα的親和力，對(duì)人可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ-脂聯(lián)素球部（sTNFRⅡ-gAD）融合蛋白進(jìn)行改構(gòu)，構(gòu)建了融合基因人可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ-脂聯(lián)素球部-Fc（sTNFRⅡ-gAD-Fc）的真核表達(dá)載體，利用富含“GC”的方法代替DHFR擴(kuò)增體系，在CHO-S細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了sTNFRⅡ-gAD-Fc快速高效表達(dá)，探索了無(wú)血清懸浮流加培養(yǎng)方法，為進(jìn)一步優(yōu)化一套高密度、高效表達(dá)該融合蛋白的大

2、規(guī)模懸浮流加培養(yǎng)工藝打下良好基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.構(gòu)建pAAV2-sTNFRⅡ-gAD-Fc和pMH3-sTNFRⅡ-gAD-Fc表達(dá)質(zhì)粒
　　通過(guò)PCR和重組PCR的方法，將人IgG1 Fc和sTNFRⅡ-gAD基因片段重組，得到融合基因sTNFRⅡ-gAD-Fc。分別克隆至不同的真核表達(dá)載體pAAV2neo-CMV-MCS-PGK-DHFR和pMH3中，構(gòu)建pAAV2-sTNFRⅡ-gAD-Fc和pMH3-s

3、TNFRⅡ-gAD-Fc重組質(zhì)粒。
　　2.建立表達(dá)sTNFRⅡ-gAD-Fc的CHO/dhfr-和CHO-S細(xì)胞株
　　脂質(zhì)體法將pAAV2-sTNFRⅡ-gAD-Fc轉(zhuǎn)染至CHO/dhfr-細(xì)胞中，電轉(zhuǎn)染法將pMH3-sTNFRⅡ-gAD-Fc導(dǎo)入CHO-S細(xì)胞中，G418篩選2周，得到穩(wěn)定表達(dá)的多克隆細(xì)胞株，單克隆化，斑點(diǎn)雜交和Western blot分析sTNFRⅡ-gAD-Fc的表達(dá)。斑點(diǎn)雜交比較sTNFRⅡ-gA

4、D-Fc在CHO/dhfr-和CHO-S細(xì)胞中的表達(dá)，選擇快速高效的富含GC的CHO-S表達(dá)體系進(jìn)行蛋白的大量制備，3輪單克隆挑選，篩出穩(wěn)定高表達(dá)的CHO-S/pMH3-sTNFRⅡ-gAD-Fc細(xì)胞株。
　　3.在CHO-S細(xì)胞中制備sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白
　　3.1貼壁培養(yǎng)
　　將篩選的高表達(dá)單克隆在T75方瓶中貼壁培養(yǎng)，隨后分別換成不含F(xiàn)BS的DMEM/F12和無(wú)血清培養(yǎng)基B001培養(yǎng)以收集上清。

5、r>　　3.2懸浮培養(yǎng)
　?、贀u瓶中懸浮批次培養(yǎng)
　　將高表達(dá)單克隆用無(wú)血清培養(yǎng)基B001懸浮馴化培養(yǎng)，得到適合懸浮生長(zhǎng)的穩(wěn)定高表達(dá)工程細(xì)胞株。
　　在搖瓶中依次進(jìn)行了60mL、120mL懸浮批次培養(yǎng)，即2.0×106cells/mL的接種密度，120rpm，37℃恒溫振蕩持續(xù)培養(yǎng)。
　?、谵D(zhuǎn)瓶及生物反應(yīng)器中流加培養(yǎng)
　　懸浮培養(yǎng)規(guī)模從搖瓶擴(kuò)大到轉(zhuǎn)瓶，最終擴(kuò)到生物反應(yīng)器，在轉(zhuǎn)瓶和反應(yīng)器中分別進(jìn)行了200mL

6、、3L的流加培養(yǎng)，即:初始接種密度2.0×106cells/mL，當(dāng)達(dá)到4.0×106cells/mL以上時(shí)開(kāi)始流加培養(yǎng)，以每日葡萄糖殘余量2g/L左右作為流加體積的控制參數(shù)。
　　4.sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白的純化
　　培養(yǎng)上清經(jīng)ProteinA瓊脂糖親和法分離純化，收集洗脫峰，SDS-PAGE和Westemblot分析。
　　5.sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白活性檢測(cè)
　　MTT法檢測(cè)sTNFR

7、Ⅱ-gAD-Fc融合蛋白中和TNFα殺傷L929細(xì)胞的活性。比較sTNFRⅡ-gAD-Fc、sTNFRⅡ-gAD和sTNFRⅡ-Fc拮抗TNFα的能力的差異。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建pAAV2-sTNFRⅡ-gAD-Fc和pMH3-sTNFRⅡ-gAD-Fc表達(dá)質(zhì)粒
　　構(gòu)建的pAAV2-sTNFRⅡ-gAD-Fc和pMH3-sTNFRⅡ-gAD-Fc重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定正確，DNA測(cè)序，在IgG1 Fe片段上存

8、在2個(gè)突變位點(diǎn)，即其第90位和186位的GTC(纈氨酸)分別突變?yōu)锳TC(異亮氨酸)和GAC(天冬氨酸)，但后期實(shí)驗(yàn)表明這兩處的點(diǎn)突變并不影響蛋白的結(jié)構(gòu)與生物活性。
　　2.成功建立穩(wěn)定高表達(dá)sTNFRⅡ-gAD-Fc的CHO/dhfr-和CHO-S細(xì)胞株
　　轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)過(guò)G418篩選及單克隆化，dot blot分析，sTNFRⅡ-gAD-Fc在CHO/dhfr-細(xì)胞中基礎(chǔ)表達(dá)量較低（10μg/mL左右），需要較長(zhǎng)的MTX

9、加壓提高表達(dá)量。而在CHO-S細(xì)胞中，僅經(jīng)過(guò)一次單克隆挑選即可獲得75μg/mL的高表達(dá)單克隆。因而，選擇在CHO-S細(xì)胞中表達(dá)該蛋白，經(jīng)過(guò)3次單克隆挑選，得到較純表達(dá)量高的單克隆以備后期大量培養(yǎng)。
　　Western blot分析，還原的sTNFRⅡ-gAD-Fc樣品，在大約75kDa處出現(xiàn)特異性條帶，非還原的樣品，僅分別在大約170kDa處和遠(yuǎn)大于250kDa處出現(xiàn)特異性條帶，提示sTNFRⅡ-gAD-Fc以二聚體和多聚體形式

10、表達(dá)，無(wú)單體蛋白。
　　3.sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白的生產(chǎn)
　　在T75方瓶中分別用不含F(xiàn)BS的DMEM/F12和B001培養(yǎng)基培養(yǎng)6-7天，蛋白純化后產(chǎn)量分別大約為5.0mg/L和7.5mg/L。
　　搖瓶中60mL、120mL批次培養(yǎng)7天，蛋白產(chǎn)量為10.0mg/L和9.2mg/L，轉(zhuǎn)瓶中200mL及反應(yīng)器中3L流加培養(yǎng)7-8天，蛋白產(chǎn)量為18.3mg/L和20.5mg/L。
　　4.sTNFRⅡ-

11、gAD-Fc融合蛋白純化
　　洗脫的蛋白經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析，證實(shí)是sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白，純度約95％。
　　5.sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白的活性
　　sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白具有顯著抑制TNFα殺傷L929細(xì)胞的活性，且呈劑量依賴(lài)性。得到sTNFRⅡ-gAD-Fc，sTNFRⅡ-gAD和sTNFRⅡ-Fc的ECs0分別為0.4904，0.3201和1.075

12、，比活分別是0.20×107u，0.31×107u，0.093×107 u。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了sTNFRⅡ-gAD-Fc的真核表達(dá)載體，在CHO/dhfr-細(xì)胞和CHO-S細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。但在轉(zhuǎn)染的CHO-S細(xì)胞中可快速篩選出高表達(dá)（75g/mL）單克隆細(xì)胞株，sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白以二聚體和多聚體形式分泌表達(dá)，該蛋白具有顯著抑制TNFα殺傷L929細(xì)胞的活性。最終利用CHO-S細(xì)胞系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了sT