木質(zhì)素過氧化物酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其在甲醇畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、木質(zhì)素過氧化物酶(Lignin peroxidase,Lip)是一種由黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)分泌的單血紅素糖蛋白.利用黃孢原毛平革菌生產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶受到許多因素的限制.例如:只有在限氮或其它不均衡的培養(yǎng)基中才能分泌木質(zhì)素過氧化物酶并且酶活較低,同時其菌絲在發(fā)酵罐中易受高剪切力的損傷.本論文以黃孢原毛平革菌5.776為出發(fā)菌株,研究了lipH8基因在甲醇畢赤酵母(Pichia meth

2、anolica)中的表達(dá).采用TRIZOL試劑提取黃孢原毛平革菌RNA,以此RNA為模板,通過RT-PCR技術(shù)進(jìn)行體外擴(kuò)增,得到了去掉自身信號肽的木質(zhì)素過氧化物酶基因(lipH8);將lipH8基因克隆至載體pUC19,獲得克隆載體pUC19-lipH8,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α;經(jīng)序列測定確認(rèn)所得到的基因與報道的木質(zhì)素過氧化物酶基因序列完全一致.將測序確認(rèn)正確的lipH8克隆至甲醇畢赤酵母整合型表達(dá)載體pMET α A,獲得酵母表達(dá)質(zhì)粒

3、pMET α A-lipH8;表達(dá)質(zhì)粒pMET α A-lipH8經(jīng)線性化后,采用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化Ade缺陷型甲醇畢赤酵母PMAD16;通過調(diào)整參數(shù),對影響電轉(zhuǎn)化效率的主要因素進(jìn)行探索,建立了質(zhì)粒pMET α A-lipH8對甲醇畢赤酵母PMAD16的高效電轉(zhuǎn)化方法;確定最佳電轉(zhuǎn)化參數(shù)為:采用對數(shù)生長中期的菌體制備感受態(tài)細(xì)胞(菌體OD<,600>為1.0-1.2),感受態(tài)細(xì)胞凍存時間不超過3周,質(zhì)粒DNA的濃度30μg/mL,場強(qiáng)為3kV/

4、cm,最高轉(zhuǎn)化率為57個轉(zhuǎn)化子/μg質(zhì)粒DNA;通過MD平板、PCR方法篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子;轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液經(jīng)SDS-PAGE分析和木質(zhì)素過氧化物酶活力測定等方法鑒定,表明去除自身信號肽的黃孢原毛平革菌木質(zhì)素過氧化物酶基因(lipH8)在甲醇畢赤酵母中得到表達(dá).通過搖瓶進(jìn)行轉(zhuǎn)化子表達(dá)條件優(yōu)化,確定工藝參數(shù)為:搖瓶培養(yǎng)時間為72h;發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L):酵母粉10,蛋白胨20,生物素4×10<'-4>,0.1mol/L磷酸緩沖液(pH6.