先天缺牙致病基因的篩查及遺傳學(xué)研究.pdf

1、牙齒發(fā)育是上皮和間充質(zhì)之間相互作用的復(fù)雜過程,許多轉(zhuǎn)錄因子和信號分子參與其中。牙齒發(fā)育不良(hypoplasiaofteeth)是人類最常見的顱面先天畸形,包括牙齒數(shù)目、形狀和結(jié)構(gòu)異常。牙齒數(shù)目異常,即先天缺牙(congenitaltoothagenesis)是人類牙列中最常見的發(fā)育異常。在人群中,單顆牙齒先天缺失比例可高達(dá)20％。在排除第三磨牙缺失比例的情況下,恒牙缺失的發(fā)病率為1.6%-9.6%,乳牙先天缺失的發(fā)病率較低。除第三磨牙

2、外,第二前磨牙和側(cè)切牙最容易受累。按缺牙數(shù)一般分為少數(shù)牙缺失(hypodontia)、多數(shù)牙缺失(oligodontia)以及全口無牙(anodontia)。其中,少數(shù)牙缺失指缺失牙齒數(shù)少于6顆;多數(shù)牙缺失指牙齒先天缺失6顆及以上(不包括第三磨牙)。牙齒先天缺失可由環(huán)境因素或遺傳因素造成。臨床上可見到散發(fā)病例和家族遺傳病例,后者可以是常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳或X染色體連鎖遺傳。先天缺牙不僅影響患者的咀嚼功能,而且影響其發(fā)音、容

3、貌及心理健康。按照是否伴有其他組織器官改變,先天缺牙可分為綜合征型和非綜合征型。外胚葉發(fā)育不良綜合征(ectodermaldysplasiasyndrome,EDs)是臨床上最常見的綜合征型先天缺牙?；純撼讼忍烊毖?還伴發(fā)其他外胚層來源組織的發(fā)育障礙,如指甲、皮膚、毛發(fā)及汗腺。臨床以排汗障礙嚴(yán)重程度,又分為少汗型和無汗型兩種。
　　大量研究表明,與先天缺牙相關(guān)的基因有200余種,一般認(rèn)為PAX9、MSX1、AXIN2和EDA基因

4、與非綜合征型先天缺牙密切相關(guān),而最常見的綜合征型先天缺牙——外胚葉發(fā)育不良綜合征,其致病基因主要為EDA、EDAR及EDARADD。
　　本研究通過臨床檢查收集先天缺牙家系,對相關(guān)候選基因進(jìn)行檢測并初步預(yù)測其功能改變,探討先天缺牙患者的基因突變位點(diǎn)及發(fā)病機(jī)制。
　　第一部分先天缺牙家系病例調(diào)查和樣本收集
　　1.材料及方法:本研究收集有先天缺牙臨床表現(xiàn)的病例,以先證者恒牙或乳牙先天缺失數(shù)目大于或等于6顆為基本納入標(biāo)準(zhǔn),

5、收集前來我科就診的無血緣關(guān)系的7個家系。以是否伴有毛發(fā)及汗腺發(fā)育異常分為綜合征型先天缺牙(少汗/無汗型外胚葉發(fā)育不良)及非綜合征型先天缺牙,繪制先天缺牙家庭家系圖譜,對家庭成員進(jìn)行相關(guān)臨床檢查及病史采集,分別分析兩種類型先天缺牙的遺傳方式,了解各自發(fā)病特點(diǎn)。采集相關(guān)實(shí)驗(yàn)室所需樣本,提取后妥善保存。
　　2.結(jié)果:7個家系均為中國漢族人群,包括5例非綜合征型先天缺牙家系及2例少汗/無汗型外胚葉發(fā)育不良家系。各家庭成員均無其他先天發(fā)育

6、缺陷。家族中無近親婚史,亦無流產(chǎn)史。非綜合征型先天缺牙受累牙位主要集中在第二前磨牙及側(cè)切牙,對于同側(cè)頜,同一牙位,側(cè)切牙缺失數(shù)目上頜多于下頜,而切牙缺失數(shù)目下頜多于上頜。對于第二前磨牙上下頜基本無差異。除一個家系中先證者乳恒牙全部缺失外,少汗/無汗型外胚葉發(fā)育不良患兒先天缺牙程度明顯較重。7個家系中,除家系5及家系7外,結(jié)合相關(guān)疾病常見遺傳方式,我們認(rèn)為家系1是常染色體顯性遺傳,家系2及家系6為X染色體顯性遺傳,家系4為X染色體顯性遺傳

7、或常染色體顯性遺傳。采集提取到了合格的DNA及cDNA樣本。
　　3.結(jié)論:先天缺牙遺傳病的遺傳特征可能是X染色體顯性遺傳或常染色體顯性遺傳。非綜合征型先天缺牙受累牙位主要集中在第二前磨牙及側(cè)切牙,就同一牙位而言側(cè)切牙缺失易發(fā)生在上頜,而切牙缺失易發(fā)生在下頜。
　　第二部分先天缺牙家系候選基因篩查及突變位點(diǎn)確定
　　1.材料及方法:查閱文獻(xiàn)結(jié)合DNAStar及Premier5.0軟件設(shè)計(jì)合成候選基因(PAX9、MSX1

8、、AXIN2、EDA、EDAR、EDARADD)引物。對非綜合征型先天缺牙家系PAX9、MSX1、AXIN2和EDA基因外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物純化后測序。對于少汗/無汗型外胚葉發(fā)育不良的家系先檢測EDA基因,后續(xù)檢測EDAR及EDARADD基因。所有測序結(jié)果參照GENEBANK相關(guān)序列進(jìn)行比對,將測得的突變位點(diǎn)同正常人群樣本比對,并查詢數(shù)據(jù)庫排除常見SNP位點(diǎn),最終結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)查新。
　　2.結(jié)果:本研究在2個非

9、綜合征型先天缺牙家系中分別發(fā)現(xiàn)2個新的EDA基因錯義突變:p.G257R,p.V309L;發(fā)現(xiàn)一個新的MSX1內(nèi)含子剪切位點(diǎn)突變:IVS1-2A>T;發(fā)現(xiàn)一個已報(bào)道PAX9基因錯義突變:p.R47W。在一個無汗型外胚葉發(fā)育不良家系中發(fā)現(xiàn)2個新的EDA基因錯義突變:p.L296V,p.E308D。另一個少汗型外胚葉發(fā)育不良家系經(jīng)基因測序驗(yàn)證為散發(fā)病例,患兒存在一個新的EDA基因錯義突變:p.E308K。這5個EDA基因突變位點(diǎn)均位于TNF

10、區(qū)域。
　　3.結(jié)論:上述3個基因新突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)證明非綜合征型先天缺牙可能與致病基因PAX9、MSX1及EDA有關(guān);并進(jìn)一步驗(yàn)證了EDA為綜合征型先天缺牙的致病基因,同時擴(kuò)大了以上基因的突變譜。
　　第三部分先天缺牙家系突變基因及其突變位點(diǎn)結(jié)構(gòu)功能預(yù)測
　　1.材料及方法:通過剪切位點(diǎn)預(yù)測網(wǎng)站比較突變前后MSX1內(nèi)含子剪切位點(diǎn)的變化。另外,對本研究發(fā)現(xiàn)的5個EDA基因新突變進(jìn)行保守性分析,模擬其蛋白產(chǎn)物三聚體三維結(jié)構(gòu)

11、,并與野生型EDA基因相對比,分析蛋白表面構(gòu)象及分子表面能量電場差異等,探討基因型與表現(xiàn)型的聯(lián)系。
　　2.結(jié)果:剪切位點(diǎn)預(yù)測顯示IVS1-2A>T突變對MSX1基因內(nèi)含子剪切產(chǎn)生重要影響。本研究發(fā)現(xiàn)的5個EDA基因突變位點(diǎn),均有高度保守性。突變EDA基因的蛋白產(chǎn)物,因氨基酸發(fā)生改變(堿基突變后翻譯得到氨基酸支鏈及電荷能量不同),使EDA基因蛋白產(chǎn)物三聚體表面構(gòu)象及分子表面能量電場都發(fā)生了較大改變。
　　3.結(jié)論:EDA,M