新基因xVAP019、FAM92A1的克隆及功能研究.pdf

1、目的：進(jìn)行非洲爪蟾新基因xVAP019和其人類同源基因FAM92A1的克隆及功能研究。 方法：以非洲爪蟾(Xenopus laevis)為研究模型，利用3、未端RT-PCR法克隆從非洲爪蟾卵母細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選到的一個(gè)高度保守的新序列表達(dá)標(biāo)簽(GenBank 3CCess ion numbers CV973659)的全長(zhǎng)基因(xVAP019)，利用生物信息學(xué)方法，分析該基因的同源性、保守性、結(jié)構(gòu)域等特點(diǎn)；半定量RT-PC

2、R和爪蟾胚胎整體原位雜交方法用來(lái)檢測(cè)其時(shí)空表達(dá)；克隆其完整ORF并構(gòu)建其pGEM T-easy克隆載體，體外轉(zhuǎn)錄mRNA和體外合成其Morpholino(反義分子)，顯微注射，研究xVAP019基因在體內(nèi)過(guò)表達(dá)和下調(diào)內(nèi)源性xVAP019基因表達(dá)時(shí)對(duì)其胚胎發(fā)育的影響；克隆xVAP019的人類同源基因FAM92A1，RT-PCR方法和DNA序列測(cè)定技術(shù)鑒定FAM92A1的新的轉(zhuǎn)錄變異體，構(gòu)建其真核表達(dá)載體pcDNA3．1-FAM92A1s，

3、以人類癌細(xì)胞系為模型，利用MTT分析法、流式細(xì)胞儀分析法、Hoechst33258染色法體外分析其過(guò)表達(dá)時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的作用；血清饑餓法使細(xì)胞周期同步化，RT-PCR法分析內(nèi)源性FAM92A1基因和外源性FAM92A1基因在不同細(xì)胞周期階段的表達(dá)情況；構(gòu)建FAM92A1基因融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pFAM92A-EGFP-N1(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)合DAPI染色，在熒光顯微鏡下觀察FAM92A1蛋白的表達(dá)及亞

4、細(xì)胞定位；RT-PCR法分析檢測(cè)FAM92A1s過(guò)表達(dá)時(shí)對(duì)p53、Rb、p27、caspase3、caspase 8、caspase 9等基因表達(dá)的影響，初步分析其影響細(xì)胞增殖和凋亡的可能機(jī)制； 結(jié)果：(1)克隆了一個(gè)非洲爪蟾新基因xVAP019，該基因編碼一個(gè)含有保守結(jié)構(gòu)域DUF1208且功能未知的蛋白質(zhì)：(2)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)xVAP019具有高度的保守性，與其人類同源基因FAM92A1等都屬于保守結(jié)構(gòu)域DUF1208家族

5、，含有多個(gè)CK2和PKC磷酸化位點(diǎn)和一個(gè)蜷曲螺旋結(jié)構(gòu)(coiled cool domain)； (3)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)xVAP019在爪蟾成體各組織及各發(fā)育階段都有表達(dá)：在卵裂期及囊胚期主要表達(dá)于動(dòng)物半球，在原腸期和神經(jīng)軸胚期表達(dá)較廣泛，但主要表達(dá)于背部外胚層和脊索中胚層及胚孔區(qū)，隨后可見(jiàn)xVAP019主要表達(dá)于背部外胚層和脊索中胚層的衍生結(jié)構(gòu)如頭部、脊索等中樞神經(jīng)系統(tǒng)區(qū)域及表皮；(4)xVAPO19體內(nèi)過(guò)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)時(shí)都嚴(yán)重影響爪蟾胚胎發(fā)育

6、，有致畸和致死性；(5)鑒定了FAM92A1的2個(gè)新的轉(zhuǎn)錄變異體FAM92A1-251、FAM92A1-289且構(gòu)建了FAM92A1及其兩個(gè)新的轉(zhuǎn)錄變異體FAM92A-251、FAM92A1-289的真核表達(dá)載體；(6)檢測(cè)了FAM92A1s在不同癌細(xì)胞系及正常細(xì)胞系中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FAM92A1-271和FAM92A1-289在癌細(xì)胞系及正常細(xì)胞系中均表達(dá)豐富，而FAM92A1-251表達(dá)較低；(7)FAM92A1-271、FAM92A

7、1-251和FAM92A1-289過(guò)表達(dá)時(shí)可影響細(xì)胞周期分布，導(dǎo)致S期進(jìn)入G/M受阻，抑制細(xì)胞增殖且可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；(8)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FAM92A1s在S期高表達(dá)，在G1和G2/M期表達(dá)較低；(9)FAM92A1s過(guò)表達(dá)時(shí)可見(jiàn)p53、Rb、caspase3、caspase 8的表達(dá)增加，未見(jiàn)caspase 9的表達(dá)；(10)發(fā)現(xiàn)FAM92A1蛋白定位于細(xì)胞核。 結(jié)論：xVAP019基因表達(dá)廣泛，編碼蛋白屬于DUF1208

8、保守結(jié)構(gòu)域家族，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，xVAP019基因參與脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中外胚層和中胚層的發(fā)育。FAM92A1為xVAP019的同源基因，體外實(shí)驗(yàn)證明，新基因蛋白FAM92A1屬核蛋白，它具有至少9個(gè)選擇性剪切體，在人卵巢癌細(xì)胞株(SKOV3)中過(guò)表達(dá)的體外實(shí)驗(yàn)顯示， FAM92A1s過(guò)表達(dá)可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、改變細(xì)胞周期分布、阻止細(xì)胞增殖于S期，并可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，表明FAM92A1參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。其機(jī)制可能與腫