擬南芥耐硒基因VSE1的克隆及功能研究.pdf

1、在主要農(nóng)作物中定位表達(dá)硒代謝關(guān)鍵酶基因來(lái)調(diào)節(jié)農(nóng)產(chǎn)品含硒水平，滿足人類健康攝硒的需要，具有重要理論與實(shí)踐價(jià)值。利用分子生物學(xué)手段分離耐硒基因，再利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出更多的耐硒植物是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。
　　正向遺傳學(xué)是指，通過(guò)生物個(gè)體或細(xì)胞的基因組的自發(fā)突變或人工誘變，尋找相關(guān)的表型或性狀改變，然后從這些特定性狀變化的個(gè)體或細(xì)胞中找到對(duì)應(yīng)的突變基因，并揭示其功能。本文從化學(xué)誘導(dǎo)型激活標(biāo)簽子系統(tǒng)構(gòu)建的突變體庫(kù)中篩選到功能獲得型耐硒突變體v

2、sel，初步鑒定對(duì)一定濃度的硒鹽(亞硒酸鈉)具有耐受性，而在正常生長(zhǎng)條件下與野生型生長(zhǎng)發(fā)育沒(méi)有明顯差異，在此基礎(chǔ)上通過(guò)Tail-PCR克隆VSE1基因，并對(duì)其在硒脅迫下的功能進(jìn)行了研究。
　　1、從XVE系統(tǒng)激活標(biāo)簽子突變體庫(kù)中篩選獲得耐硒突變體vse1。在5mg/L，Na2SeO3和10μMβ-estradiol+5mg/LNa2SeO3作用下，vse1突變體較WT表現(xiàn)出顯著的耐硒性狀。遺傳分析反應(yīng)，調(diào)控vse1突變體耐硒性狀的

3、基因以隱性單基因的調(diào)控方式進(jìn)行。另外，vse1突變體對(duì)H2O2脅迫有明顯的耐受作用，暗示vse1突變體對(duì)硒耐受的途徑可能與抗氧化系統(tǒng)有關(guān)。
　　2、采用Tail-PCR技術(shù)，克隆了擬南芥VSE1基因(AT1G07890)。VSE1基因編碼一個(gè)胞質(zhì)型抗壞血酸過(guò)氧化物酶(cAPX)，APX是植物體內(nèi)的重要酶系，是植物AsA-GSH氧化還原途徑的重要組分，是清除H2O2的關(guān)鍵酶。氨基酸序列比對(duì)分析顯示，VSE1基因編碼的蛋白質(zhì)與甘藍(lán)(B

4、rassica oleracea)有較高的相似性。
　　3、通過(guò)對(duì)VSE1基因表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，VSE1基因在突變體中被敲除，在各組織中表達(dá)水平具有差異性，在果莢中的表達(dá)量最高，而在蓮座葉中的表達(dá)量最低。組織中硒含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，vse1突變體根中硒含量顯著高于WT。分析AtGPX、AtHMT、AtGSH和AtATM等四個(gè)硒脅迫相關(guān)基因的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，硒脅迫下的vse1突變體AtGPX和AtGSH的表達(dá)量高于野生型，而AtHMT、和A

5、tATM表達(dá)量無(wú)差異。另外在硒脅迫下，vse1突變體比WT要更加耐受，而在0.2mMBSO+5mg/L Na2SeO3的培養(yǎng)條件下，vse1突變體對(duì)硒耐受表型消失，說(shuō)明vse1突變體對(duì)硒的耐受性可能與GSH途徑以及AtGPX和AtGSH表達(dá)量增加有關(guān)。此外，vse1突變體對(duì)H202脅迫響應(yīng)以及DAB對(duì)H202的組化檢測(cè)說(shuō)明VSE1基因敲除對(duì)硒脅迫耐受可能與抗氧化系統(tǒng)有關(guān)。以上研究結(jié)果表明VSE1基因通過(guò)激活A(yù)tGPX和AtGSH，硒螯合