阿德福韋酯耐藥模式及其免疫選擇特性研究.pdf

1、背景與目的：
　　 慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)感染是一個(gè)重大的公共健康問題，全世界約有4億人慢性感染。乙型肝炎病毒(hepatiis B virus，HBV)高度流行區(qū)主要分布在南非、中國、東南亞、地中海地區(qū)。慢性乙型肝炎治療，抗病毒是關(guān)鍵，將病毒復(fù)制控制在一個(gè)最低的水平，從而減緩或中止肝臟疾病的進(jìn)程，預(yù)防并發(fā)癥的出現(xiàn)。目前抗病毒治療的藥物主要有兩種類型，IFN-γ和HBV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(Nu

2、cleoside Reverse Transcriptase Inhibitors，NRTIs)。IFN-γ的效果有限，約40％的患者對(duì)其低應(yīng)答，NRTIs長期使用可產(chǎn)生耐藥突變株及停藥反彈。目前HBV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑分為三種結(jié)構(gòu)類型：L-核苷類似物，無環(huán)腺苷膦酸酯，脫氧鳥苷類似物。目前有5種NRTIs在美國和歐洲被批準(zhǔn)用于HBV治療：拉米夫定(LAM)、阿德福韋酯(ADV)、恩替卡韋(ETV)、替比夫定(LDT)和替諾福韋(TDF)。L

3、AM和ADV是CHB治療的一線藥物。大部分情況下，CHB的治療使用單個(gè)NRTIs在短期內(nèi)可快速抑制HBV復(fù)制，但長期使用，由于藥物耐藥HBV株的出現(xiàn)，會(huì)出現(xiàn)一種不佳的治療效應(yīng)，藥物耐藥作為治療失敗的最重要的因素出現(xiàn)。NRTIs治療失敗帶來一個(gè)重要的臨床挑戰(zhàn)，限制了后續(xù)治療的選擇范圍，因此抗病毒藥物耐藥受到廣泛關(guān)注。
　　 ADV是一個(gè)對(duì)HBV野生株和LAM耐藥株均有效的核苷類似物，在LAM補(bǔ)救治療中起重要作用。ADV耐藥出現(xiàn)比L

4、AM耐藥晚，但在LAM治療失敗的患者中，阿德福韋酯治療時(shí)耐藥性的發(fā)展非常迅速。單一氨基酸的變化，rtN236T和/或rtA181V/T置換，均足以導(dǎo)致ADV臨床治療失敗，是ADV耐藥的典型位點(diǎn)。其他與ADV治療失敗有所關(guān)聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄區(qū)序列位點(diǎn)改變，包括rtL80V/I、rtv84M、rtV214A、rtS85A、rtQ215S、rtE218G、rtP237H和rtN238T/D/H，可單獨(dú)出現(xiàn)或聯(lián)合rtN236T與rtA181V/T出現(xiàn)。

5、HBV多聚酶改變在ADV治療失敗中僅僅在少數(shù)的臨床分離中被檢測出，懷疑有更多的未知因素造成阿德福韋酯臨床耐藥。影響NRTIs治療應(yīng)答和耐藥發(fā)生的因素很多，HBV基因型是常見被報(bào)道的因素之一。很多研究的結(jié)果也有所差異。目前普遍認(rèn)為HBV基因型對(duì)耐藥的出現(xiàn)和耐藥突變的類型有一定的影響。LAM的耐藥突變YMDD與HBV基因型相關(guān)的報(bào)道較多，認(rèn)為HBV基因型對(duì)YMDD突變發(fā)生率沒有太大的影響，但影響YIDD/YVDD變異的類型。在ADV治療中，

6、有研究者認(rèn)為其耐藥突變的發(fā)生率在基因型A和D患者中無明顯差異，也有研究者認(rèn)為ADV的耐藥或許主要出現(xiàn)在B和D基因型中。目前尚有爭議。
　　 HBV自然變異速率較RNA低，而核苷類似物干預(yù)加速了病毒變異，并特異性選擇逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)。HBV在阿德福韋酯干預(yù)下出現(xiàn)的變異是否會(huì)打破與宿主長期共進(jìn)化的免疫平衡，導(dǎo)致細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)表位的變化，從而與肝炎的發(fā)作相關(guān)。目前有報(bào)道認(rèn)為RT區(qū)的

7、變異能夠引起免疫反應(yīng)的變化，如rtM204I基礎(chǔ)上聯(lián)合rtL180M變異可能導(dǎo)致突破后肝炎，但相關(guān)的研究還較少，特別是對(duì)ADV耐藥變異帶來的免疫影響。
　　 由于ADV基因耐藥患者出現(xiàn)較少，對(duì)該類患者的研究樣本普遍偏小，多為研究ADV應(yīng)答效果的附帶結(jié)果，本研究花長時(shí)間收集了較大的樣本量，更詳細(xì)的分析ADV臨床應(yīng)答不佳的原因和耐藥突變類型與HBV基因型以及其他臨床因素的關(guān)系，特別是rt181的變異類型的影響因素及對(duì)HBsAg的影響

8、，目前國內(nèi)外尚缺乏相關(guān)資料。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究ADV耐藥株的表位漂移情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.161例ADV臨床耐藥的CHB患者進(jìn)行了RT區(qū)測序，135例患者為ADV治療中出現(xiàn)病毒反彈患者，26例為ADV早期不應(yīng)答患者。在發(fā)生病毒學(xué)反彈患者中，ADV基因耐藥組的年齡42.20±7.99歲，和ADV治療療程30.01±11.03月，均比無基因耐藥組高(年齡33.57±9.69歲，治療療程19.97±10.86

9、月)(P=0.000)，無基因耐藥組HBeAg陽性率85.2％高于基因耐藥組56.8％(P=0.000)。ADV早期無應(yīng)答患者大多(24/26)未檢出基因耐藥(P=0.000)。
　　 其中在74例ADV治療過程中發(fā)生病毒學(xué)反彈并檢測出基因耐藥的患者中，有19例同時(shí)發(fā)生rt181+rt236變異，余55例為單一rt181或者rt236位點(diǎn)變異患者，將發(fā)生不同基因耐藥位點(diǎn)突變的12個(gè)可能影響因素進(jìn)行單因素分析和多因素回歸分析，HB

10、V基因分型和合并肝硬化影響兩個(gè)位點(diǎn)的選擇(P=0.002和P=0.026)。Rt236位點(diǎn)變異組中88.9％為基因型B，與重慶地區(qū)HBV基因型的分布及ADV臨床耐藥、基因耐藥、rt181變異組差異顯著(P<0.05)。
　　 在48例ADV治療過程中發(fā)生病毒性反彈和檢測出rt181位點(diǎn)變異的患者中，將可能影響rtA181T、rtA181V變異類型的選擇因素進(jìn)行單因素分析和多因素回歸分析，rtN236T變異和ADV治療療程均為rt

11、181位點(diǎn)突變類型的影響因素(P=0.007，P=0.024)。RtN236T變異與rtA181T同時(shí)出現(xiàn)更為常見。出現(xiàn)rtA181V變異患者的治療療程要長于rtA181T患者。
　　 2.161例接受ADV治療并發(fā)生臨床耐藥患者，rt238位點(diǎn)為N氨基酸者共46例，占28.6％，為H的有105例，占65.2％，為T的9例，占5.6％，另有1例為罕見的rtN238Q。在基因耐藥和無基因耐藥患者中，HBV氨基酸序列的rt238位點(diǎn)

12、氨基酸差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.709)。Rt238的三種不同類型氨基酸在HBV基因型中差異顯著(x2=83.874，P=0.000)。RtN238H主要出現(xiàn)在基因型B患者中，rtN238主要出現(xiàn)在基因型C患者中，而rtN238T的HBV序列全部為基因型C。Rt238的氨基酸類型在ADV突變的三種模式rt181、rt236、rt181+rt236中有顯著差異(x2=25.640，P=0.000)。采用偏相關(guān)分析，控制HBV基因型，rt2

13、38氨基酸類型與三種突變模式無明顯相關(guān)(P=0.347)。
　　 在ADV單藥治療和LAM-ADV序貫治療組中，rt238的氨基酸差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=1.262，P=0.532)。且在6例ADV治療患者治療前后，rt238位點(diǎn)的氨基酸均無變化，其中有2例為rtN238H，4例為rtN238。
　　 對(duì)照52例LAM耐藥和26例未經(jīng)治療的CHB患者，rt238位點(diǎn)氨基酸類型分別在LAM組和未經(jīng)治療的野生株中分布與HBV

14、基因型均有關(guān)(P=0.000)。HBV基因型在未經(jīng)治療患者中與LAM單藥耐藥組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=8.751，P=0.003)，而與ADV單藥耐藥組無顯著差異(x2=0.573，P=0.449)。Rt238位點(diǎn)的氨基酸類型在未經(jīng)治療組、LAM單藥耐藥組、ADV單藥耐藥組中分布無顯著差異(P=0.326)。
　　 3.LAM單藥誘導(dǎo)rt181變異的7例患者中，以rtA181T為主，有5例，占71.4％，ADV單藥誘導(dǎo)的15例

15、rt181變異患者中，8例是rtA181V型，7例rtA181T，兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.139，P=0.067)。比對(duì)兩治療組患者的序列，發(fā)現(xiàn)rt223位點(diǎn)氨基酸類型與治療組有關(guān)，在兩個(gè)治療組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=5.455，P=0.020)，在ADV治療組中，rtA223有12例，占80％，在LAM治療組中，rtS223有5例，占71.4％。采用偏相關(guān)分析，控制HBV基因型的影響，rt223位點(diǎn)氨基酸類型同樣與治療組存在

16、正相關(guān)關(guān)系(P=0.013)。在不同基因型中rt221、rt223、rt224、rt238位點(diǎn)的氨基酸類型均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001；P=0.010；P=0.035；P=0.011)。
　　 4.在15例rt181變異發(fā)生后的血清中，在不同基因型中HBsAg差異顯著(P=0.037)，HBsAg半定量在7例基因型B患者中為8341.57±1510.01S/COI，在8例基因型C患者中為5688.05±2651.79S/COI

17、。同時(shí)發(fā)生rt236變異的血清中HBsAg水平明顯高于無rt236變異患者(P=0.008)。
　　 兩例rt181不同變異類型患者多個(gè)變異前后時(shí)相點(diǎn)分析，發(fā)生rtA181T變異的患者，發(fā)生變異時(shí)，HBsAg的升高幅度較小。發(fā)生rtA181V變異的患者，各個(gè)時(shí)相點(diǎn)的HBV DNA對(duì)數(shù)值與HBsAg之間顯著相關(guān)(P=0.001)，發(fā)生變異時(shí)相點(diǎn)HBV DNA與HBsAg的變化趨勢相反。
　　 5.2例ADV耐藥的HLA_A

18、2型患者進(jìn)行治療前后的HBV全序列表位預(yù)測。兩例患者均在強(qiáng)抗原性區(qū)域LHB346-354、LHB382-390、LHB388-396出現(xiàn)了氨基酸的改變。針對(duì)LHB346-354表位的變化，本研究利用來源于蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的HLA-A2計(jì)算機(jī)分子模型，對(duì)變異前后的3條表位肽與HLA-A2的結(jié)合情況進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)模擬，變異后表位WFSLLVPFV與MHC分子形成了更強(qiáng)的氫鍵作用。三個(gè)肽與MHC分子間親和力由大到小為WFSLLVPFV>

19、WLSLLVPFV>RLSLLVPFV。
　　 LHB346-354、LHB382-390、LHB388-396三個(gè)表位變異前后九肽進(jìn)行CTL細(xì)胞表位功能驗(yàn)證，檢測的表位肽均高于陰性對(duì)照，2號(hào)患者的LHB346-1表位甚至高于陽性對(duì)照。
　　 2例HLA_A*1101型ADV耐藥患者，預(yù)測X87-95是CTL表位的可能性大。LHB346-354表位未預(yù)測出，將該表位與MHC分子對(duì)接(HLA_A*1101)，發(fā)現(xiàn)WFSLL

20、VPFV與MHC分子也有較強(qiáng)的親和性。
　　 結(jié)論：
　　 1.ADV臨床耐藥患者中大多無ADV基因耐藥突變，提示除耐藥突變外其他因素可能影響ADV應(yīng)答。
　　 2.通過比較rt181和rt236位點(diǎn)單一變異的ADV治療患者臨床和病毒學(xué)因素，提示HBV基因型是選擇ADV耐藥突變位點(diǎn)的重要影響因素。
　　 3.首次提出rt181突變類型受ADV治療療程和rt236位點(diǎn)變異的影響。RtN236T在rtA181

21、T突變患者中更為常見，rtA181T突變在ADV治療中出現(xiàn)較rtA181V早。
　　 4.RtH238是重慶地區(qū)常見的病毒株，與治療無關(guān)，與HBV基因型B有關(guān)。
　　 5.LAM單藥誘導(dǎo)的rt181位點(diǎn)變異以rtA181T為主，ADV單藥誘導(dǎo)的rt181變異以rtA181V為主。
　　 6.首次發(fā)現(xiàn)在不同藥物誘導(dǎo)的rt181變異患者中，rt223位點(diǎn)氨基酸類型與治療藥物有關(guān)，提示其可能影響病毒對(duì)核苷類似物的應(yīng)答。

22、
　　 7.Rt221、rt223、rt224、rt238位點(diǎn)均為HBV基因型依賴位點(diǎn)。
　　 8.HBsAg滴度與HBV DNA水平相關(guān)，rt181耐藥突變在一定程度上影響HBsAg的表達(dá)。
　　 9.LHB346-354、LHB382-390、LHB388-396經(jīng)預(yù)測和驗(yàn)證為HLA_A2的CTL細(xì)胞表位，且易于在ADV治療中出現(xiàn)氨基酸置換，從而影響免疫應(yīng)答。
　　 10.LHB346-354(重疊r