腦出血大鼠神經干細胞移植后IL-2、IL-10的表達及中藥干預的影響.pdf

1、研究背景腦出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)是急性腦血管病中的危重類型，腦出血后最初30天的死亡率是43-51％，存活者75％留有不同程度殘疾，致使病人生活質量嚴重下降，同時也給社會、家庭帶來了嚴重的負擔。神經干細胞(neural stem cells，NSC)的發(fā)現(xiàn)給腦血管疾病的治療帶來新的希望，但由于腦出血后內源性神經干細胞發(fā)生的數目有限，不足以修復腦出血后神經損傷，因此用外源性神經干細胞移植治療腦出血

2、有可能取得滿意的效果。然而腦出血后血腦屏障破壞，大量血液細胞侵入腦內，其中免疫細胞激活導致細胞因子釋放。這種腦內環(huán)境的改變既可促進小膠質細胞等細胞表面表達主要組織相容性復合物(MHC)分子，促進抗原遞呈及識別，也可誘導神經干細胞NIHC分子的表達，腦內原有的“免疫豁免”環(huán)境發(fā)生了改變，可誘發(fā)免疫排斥反應，加重組織損傷。 根據免疫反應理論，腦出血血腦屏障損傷情況下，用NSC移植治療可能發(fā)生移植物抗宿主反應(GVHD))，即以Th1

3、為主，Th2、CTL參與的免疫反應。Th1釋放許多細胞因子，如IL-2、IFN-γ等，引起腦組織引起炎癥反應。IL-2無論在腦出血的炎癥反應或免疫排斥過程中，均起著關鍵作用。Th2分泌的IL-10、IL-4與免疫移植中免疫耐受有密切關系。 目的：本研究旨在通過觀察瀉火補腎湯對白介素-2(interleukin 2，IL-2)和白介素-10(interleukin 10、IL-10)在NSC移植后腦出血大鼠腦內表達的影響，探討瀉火

4、補腎湯在NSC移植免疫反應中的作用及可能機制。 方法：1.分離培養(yǎng)初生3-5天SD大鼠海馬組織神經干細胞，用nestin抗原免疫細胞化學鑒定，然后進行傳代。2.用補體依賴性細胞毒實驗方法(CDC)檢測SD大鼠的群體反應性抗體(Paner reactiveAntibody,PRA)值，選取致敏、高敏大鼠260只準備進行神經干細胞移植實驗；3.260只大鼠隨機分為A組(正常組，n=10)、B組(假手術組，n=10)、C組(腦出血組，

5、n=50)、D組(腦出血瀉火補腎湯組，n=50)、E組(腦出血NSC移植組，n=50)及F組(腦出血NSC移植加瀉火補腎湯組，n=50)，Ⅶ型膠原酶注入蒼白球復制腦出血模型，術后2d進行NSC移植，第2d、4d、7d、14d、28d分5批處死，取腦組織標本，分別用RT-PCR及免疫組化(SABC)方法檢測大鼠腦組織IL-2、IL-10mRNA和蛋白的表達水平。 結果: 1.免疫組化 (1)免疫組化檢測腦內IL-2

6、蛋白表達：正常組腦組織見陽性細胞少量表達，各組術后2d可見陽性細胞明顯增多，4d達到高峰(P<0.05)，其中E組染色陽性細胞最多，7d、14d逐漸減少，28d B、C、D、F組基本回落至正常，但E組與正常組比較仍表達有增高(P<0.01)。各組各時間點中E組IL-2表達最強(P<0.05)。同時間點F組比E組、D組比C組IL-2表達減弱(P<0.05)，陽性細胞主要分布于血腫周邊組織，根據形態(tài)判斷主要為少突膠質細胞。 (2)免

7、疫組化檢測腦內IL-10蛋白表達：正常腦組織見少量陽性細胞散在分布，各組術后2d可見表達升高，14d時達峰值(P<0.05)，28d時陽性細胞明顯減少(P<0.05)。各組各時間點中F組IL-10表達最強(P<0.05)。同時間點除28d外，F(xiàn)組比E組、D組比C組IL-10表達增強(P<0.05)。染色陽性的細胞主要分布于血腫周邊組織，根據形態(tài)判定主要為纖維性星型膠質膠質細胞。 2.RT-PCR(1)RT-PCR檢測腦內IL-2

8、 mRNA表達：正常組IL-2 mRNA僅有極少量表達，2d時B、C、D、E、F五組IL-2 mRNA表達較A組顯著升高(P<0.01)，且4d時達到表達高峰(P<0.05)，其中E組表達最強(P<0.05)。7d、14d時IL-2 mRNA表達逐漸下降(P<0.05)，28d時B、C、D、F 4組基本減少至正常，但E組與正常組比較表達仍有增高(P<0.05)。同時間點，F(xiàn)組比E組、D組比C組IL-2 mRNA表達明顯減弱(P<0.05

9、)。 (2)RT-PCR檢測腦內IL-10 mRNA表達：正常組IL-10 mRNA有少量表達。2d后B、C、D、E、F五組IL-10 mRNA表達較A組升高，其中F組(腦出血神經干細胞移植加瀉火補腎湯組)表達最強(P<0.01)，7d逐漸增強(P<0.05)，14d時可見B、C、D、E四組IL-10mRNA表達高峰(P<0.05)，28d B、C、D、E、F五組較14d表達下調。同時間點，F(xiàn)組比E組、D組比C組IL-10 mR