瀉火補(bǔ)腎湯對(duì)腦出血神經(jīng)干細(xì)胞移植后免疫排異中IL-2、IL-10表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景；腦出血后留有不同程度的偏癱、失語(yǔ)等殘疾，致使病人生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSC)的發(fā)現(xiàn)給腦血管疾病的治療帶來(lái)新的希望，但由于腦出血后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生的數(shù)目有限，不足以修復(fù)腦出血后神經(jīng)損傷，因此用外源性神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦出血有可能取得滿意的效果。然而腦出血后血腦屏障破壞，大量血液細(xì)胞侵入腦內(nèi)，其中免疫細(xì)胞激活導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放。這種腦內(nèi)環(huán)境的改變既可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面表達(dá)主要組

2、織相容性復(fù)合物(MHC)分子，促進(jìn)抗原遞呈及識(shí)別，也可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞MHC分子的表達(dá)，腦內(nèi)原有的“免疫豁免”環(huán)境發(fā)生了改變，可誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)，加重組織損傷。 根據(jù)免疫反應(yīng)理論，腦出血血腦屏障損傷情況下，用NSC移植治療可能發(fā)生移植物抗宿主反應(yīng)(GVHD)。即以TH1為主，TH2、CTL參與的免疫反應(yīng)。TH1釋放許多細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α等。IFN-γ作用于內(nèi)皮細(xì)胞，選擇性誘導(dǎo)黏附分子VCAM-1的表達(dá)，白細(xì)胞穿越毛

3、細(xì)血管壁，游出至腦組織引起炎癥反應(yīng)。血管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)論在腦出血的炎癥反應(yīng)或免疫排斥過(guò)程中，均起著關(guān)鍵作用。 目的；本研究旨在通過(guò)觀察瀉火補(bǔ)腎湯對(duì)白介素-2(interleukin2，IL-2)和白介素-10(IL-10)在NSC移植后腦出血大鼠腦內(nèi)及IFN-γ干預(yù)大鼠腦微血管肉皮細(xì)胞(rat cerebral microvascular endothelial cells，RCMECs)中的表達(dá)的影響，探討瀉火補(bǔ)腎湯在NSC移植免

4、疫反應(yīng)中作用。 方法1．大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、腦出血組、NSC移植組及瀉火補(bǔ)腎湯組，Ⅶ型膠原酶注射復(fù)制腦出血模型，術(shù)后2d進(jìn)行NSC移植，第4d， 7d分兩批處死，分別用Western blot及ELISA觀察大鼠腦組織及外周血IL-2、IL-10和蛋白表達(dá)的變化，周TUNEL觀察細(xì)胞凋亡情況。 2．分離原代鼠腦微血管肉皮細(xì)胞，隨機(jī)分為空白組、IFN-γ刺激組、正常血清對(duì)照組、瀉火補(bǔ)腎湯組，IFN-γ干預(yù)4h后分

5、別用正常血清、含瀉火補(bǔ)腎湯血清孵育4h。用RT-PCR及ELISA觀察IL-2、IL-10mRNA和蛋白表達(dá)水平，用TUNE觀察細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果 體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 1．腦出血進(jìn)行側(cè)腦室下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞移植治療的最佳治療時(shí)間是出血后第2天。 2．在正常鼠腦中，未見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。腦出血后可見(jiàn)較多TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，主要分布于出血區(qū)周?chē)?，NSC移植后4天、7天TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)增加，與腦出血組比較差異顯著(

6、P<0.05)；瀉火補(bǔ)腎湯干預(yù)后陽(yáng)性細(xì)胞較NSC移植組明顯減少(P<0.05)，神經(jīng)干細(xì)胞移植后各組7d較4d細(xì)胞凋亡減少。 3．IL-2的檢測(cè)： (1)ELISA檢測(cè)血清中IL-2蛋白表達(dá)：4天時(shí)，正常組、假手術(shù)組血清IL-2有輕度表達(dá)，腦出血組、NSC移植組血清IL．2水平較正常組和假手術(shù)組明顯上升，瀉火補(bǔ)腎湯組血清IL-2水平低于腦出血組及NSC移植紐；7天時(shí)，腦出血組、NSC移植組、瀉火補(bǔ)腎湯血清IL-2水平較4

7、d表達(dá)減少，NSC移植組IL-2表達(dá)水平最高，瀉火補(bǔ)腎湯組血清IL-2水平低于腦出血組及NSC移植組。 (2)Western bolt檢測(cè)腦內(nèi)IL-2蛋白表達(dá)：4天時(shí)，正常組、假手術(shù)組IL-2有輕度表達(dá)，腦出血組、NSC移植組、瀉火補(bǔ)腎湯組IL-2水平較正常組和假手術(shù)組明顯上升，NSC移植組表達(dá)最強(qiáng)，瀉火補(bǔ)腎湯組IL-2表達(dá)較NSC移植紐減少；7天時(shí)各組表達(dá)差異比較同4天，各組與4天比較表達(dá)減輕，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 4．IL-10

8、的檢測(cè)： (1)ELISA測(cè)血清中IL-10蛋白表達(dá)：4天時(shí)，正常組、假手術(shù)組血清檢測(cè)到較高水平的1L-10表達(dá)；腦出血組、NSC移植組、瀉火補(bǔ)腎湯組大鼠IL-10較正常組、假手術(shù)組IL-10表達(dá)顯著降低，瀉火補(bǔ)腎湯組較腦出血組IL-10表達(dá)增加；7天時(shí)腦出血組、NSC移植紐、瀉火補(bǔ)腎湯組大鼠IL-10較乏正常組、假手術(shù)組IL-10表達(dá)減輕，三組間沒(méi)有顯著性差異(2)Western bolt檢測(cè)腦內(nèi)IL-10蛋白表達(dá)情況：4天時(shí)

9、，正常組、假手術(shù)組IL-10有輕度表達(dá)，腦出血組、NSC移植組、瀉火補(bǔ)腎湯組IL-10水平較正常組和假手術(shù)組明顯上升，NSC移植組表達(dá)最弱，瀉火補(bǔ)腎湯組IL-10表達(dá)NSC移植組明顯增加；7天時(shí)腦出血組與NSC移植組、瀉火補(bǔ)腎湯組比較已沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而瀉火補(bǔ)腎湯組IL-10表達(dá)仍明顯強(qiáng)于NSC移植組。 體外實(shí)驗(yàn)： 1．IFN-γ刺激腦微血管肉皮細(xì)胞模擬免疫損傷模型，確定IFN-γ刺激濃度最佳為40ng/ml，5％瀉火補(bǔ)

10、腎湯血清作用4h作為最佳的干預(yù)條件。 2．IL-2的檢測(cè)： (1)ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-2蛋白表達(dá)：IFN-γ刺激后，IFN-γ，組、正常血清組、瀉火補(bǔ)腎湯組細(xì)胞上清IL-2較空白對(duì)照組表達(dá)增加，瀉火補(bǔ)腎湯干預(yù)后與IFN-γ組、正常血清組比較IL-2表達(dá)減少。 (2)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：IL-2：空白組大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)IL-2mRNA表達(dá)；IFN-γ干預(yù)后，IL-2mRNA表達(dá)顯著增加；正常血清組

11、較IFN-γ刺激紐顯著減少；瀉火補(bǔ)腎湯血清孵育后IL-2mRNA表達(dá)較正常血清組明顯降低。 3．IL-10的檢測(cè)： (1)ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-10蛋白表達(dá)：IFN-γ刺激后，IFN-γ刺激組、正常血清組、瀉火補(bǔ)腎湯組細(xì)胞上清IL-10較空白對(duì)照組表達(dá)減少，瀉火補(bǔ)腎湯干預(yù)后能上調(diào)IL-10的表達(dá)，與IFN-γ刺激組、正常血清組比較IL-2表達(dá)增加。 (2)RT．PCR空白組大鼠腦微血管肉皮細(xì)胞有IL-10

12、mRNA表達(dá)；IFN-γ干預(yù)后，IL-10mRNA表達(dá)降低；正常血清組較IFN-γ刺激組表達(dá)增加;瀉火補(bǔ)腎湯組IL-10mRNA表達(dá)較正常血清組明顯增加。 4．TUNEL檢測(cè)：NF-γ干預(yù)后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞可見(jiàn)大量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，瀉火補(bǔ)腎湯組與正常血清組、IFN-γ干預(yù)組比較TUNEL細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少。 結(jié)論 1．出血大鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植后IL-2表達(dá)上調(diào)，IL-10表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞凋亡增加。瀉火補(bǔ)腎湯能下