三氯乙烯皮膚染毒對豚鼠相關(guān)免疫因子IL-10和IL-10基因mRNA表達(dá)的影響.pdf

1、目的： 三氯乙烯 (trichloroethylene，TCE) 是一種揮發(fā)性的脂溶性小分子有機(jī)化合物，在工業(yè)上常用做金屬去污劑、干洗劑、溶劑等，而且其應(yīng)用呈上升趨勢。TCE在生產(chǎn)和使用過程中 TCE主要經(jīng)呼吸道和皮膚進(jìn)入體內(nèi)，TCE除可導(dǎo)致心臟、肝、腎和神經(jīng)系統(tǒng)損傷外，還可導(dǎo)致明顯的皮膚損害，主要表現(xiàn)為職業(yè)性皮炎，原發(fā)性刺激、脫脂等。近年來 TCE接觸工人藥疹樣皮炎的發(fā)病率不斷上升，發(fā)病以皮膚過敏癥狀為主要表現(xiàn)，其發(fā)生的確切機(jī)

2、理目前尚不清楚，推測可能為TCE或其代謝產(chǎn)物所致的過敏性接觸性皮炎，與參與機(jī)體免疫應(yīng)答的免疫因子(如IL-10等)有關(guān)。IL-10主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是強(qiáng)有力的抗炎因子，可通過抑制多種活化的單核細(xì)胞產(chǎn)生免疫因子發(fā)揮其抗炎活性，IL-10能抑制共刺激的表達(dá)，下調(diào)和抑制前炎癥性細(xì)胞因子的活性，因此本研究在建立了TCE致皮膚過敏的豚鼠動物模型的基礎(chǔ)上研究豚鼠在TCE致敏后皮膚炎癥的變化及相關(guān)免疫因子IL-10表達(dá)水平，為進(jìn)一步探索TCE致

3、過敏性皮炎的免疫學(xué)機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。 方法: 1、三氯乙烯皮膚染毒豚鼠藥疹性皮炎動物模型的建立：按《OECD Guideline fortesting of chemicals》(No．406)皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗豚鼠最大值法進(jìn)行試驗。實驗用豚鼠隨機(jī)分成實驗組(14只)、陰性對照組(8只)及陽性對照組(8只)，每組動物雌雄各半。在正式實驗的第1d和第8d各進(jìn)行1次致敏接觸，在第21d進(jìn)行激發(fā)。于激發(fā)后48h觀察和記錄各組動物

4、皮膚反應(yīng)情況，隨后麻醉動物，采血分離血清并摘除豚鼠脾臟，用于測定IL-10含量。剪取皮膚組織一部分用于病理組織學(xué)觀察，另一部分存放液氮罐，用于RT-PCR檢測。 2、脾組織勻漿及血清中IL-10測定：三組實驗動物采取心臟放血收集血液。然后在無菌環(huán)境下取出脾。所有全血進(jìn)行低溫離心取血清。脾組織用勻漿器以磷酸緩沖液為勻漿介質(zhì)制備10％脾組織勻漿，離心，取上清液測定IL-10水平。檢測方法采用ELISA法，按照豚鼠IL-10(通用型)

5、試劑盒說明操作。 3、各組動物皮膚組織總RNA的提?。喊碩RIzol試劑盒說明書對組織進(jìn)行總RNA的提取，總RNA經(jīng)無RNA酶處理以去除可能污染的DNA，之后在核酸定量儀下測定其濃度和純度，并取5ul總RNA于2％瓊脂糖凝膠電泳后，于紫外線分析儀下檢測總RNA的完整性。 4、各組動物皮膚組織中IL-10mRNA水平的測定：通過對實驗組、陽性對照組、陰性對照組染毒動物皮膚進(jìn)行總RNA的抽提，用RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)?/p>

6、反應(yīng))的方法，以β-actin作為內(nèi)參照半定量檢測IL-10基因mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果: 1．三氯乙烯皮膚染毒豚鼠藥疹性皮炎動物模型 1．1 皮膚致敏反應(yīng)陽性對照組8只動物均出現(xiàn)經(jīng)斑及水腫反應(yīng)，致敏率為100％；實驗組14只動物中有9只出現(xiàn)紅斑，其中6只動物表現(xiàn)出輕微的水腫，其余3只紅斑與水腫程度均低于陽性對照組，致敏率為64.29％。陰性對照組皮膚未見異常。 1．2 病理組織學(xué)檢查實驗組動物棘層明顯增

7、厚，棘細(xì)胞內(nèi)水腫較普遍，真皮內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)張、水腫，單核細(xì)胞浸潤，變應(yīng)性明顯。陽性對照組動物角質(zhì)層、粒細(xì)胞層中炎癥細(xì)胞浸潤，粒細(xì)胞輕度腫脹，基底層細(xì)胞未見異常，真皮層也有散在炎癥細(xì)胞浸潤管擴(kuò)張，水腫。陰性對照組角質(zhì)層角化完全，棘層無增厚，真皮內(nèi)未見毛細(xì)管擴(kuò)張、水腫和炎癥細(xì)胞浸潤。 2．脾組織勻漿和血清中IL-10水平測定 2．1 脾組織勻漿中IL-10水平測定實驗組(n=14)IL-10水平測定結(jié)果為241.1±51.79

8、(x±s pg/mL)，陽性對照組(n=8)IL-10水平為159.5±5.28(x±s pg/mL)，陰性對照組(n=8)IL-10水平為52.34±3.14(x±spg/mL)。實驗組IL-10水平與陰性對照組IL-10水平相比，差異具有顯著性(P<0.01)。 2．2 血清中IL-10水平測定實驗組(n=14) IL-10水平測定結(jié)果為32.7±5.48(x±s pg/mL)，陽性實驗組(n=8)IL-10水平11.7±5

9、.55(x±s pg/mL)，陰性對照組(n=8)IL-10水平5.32±3.20(x±spg/mL)。實驗組與陰性對照組相比，差異具有顯著性(P<0.05)。 3．皮膚組織中總RNA的完整性及純度分析從各組動物的皮膚組織中提取總RNA，并在核酸蛋白定量儀上進(jìn)行檢測，其OD260/OD280值均在1.9～2.0之間，表明總RNA較純，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示28S及18S條帶清晰，且28S條帶的亮度是18S的2倍，5S條帶未見或隱

10、約可見，表明總RNA完整無降解，可用于進(jìn)一步定量測量。 4．RT-PCR測定皮膚組織中IL-10 mRNA表達(dá)水平抽提待檢皮膚組織總RNA，經(jīng)兩步法RT-PCR擴(kuò)增后，獲得IL-10 cDNA擴(kuò)增片段。用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RT-PCR產(chǎn)物，并用凝膠成像系統(tǒng)掃描IL-10和β-Actin電泳條帶，結(jié)果顯示與陰性對照組相比，實驗組和陽性對照組IL-10基因mRNA表達(dá)水平有不同程度的升高。 結(jié)論: 1．用三氯乙烯反復(fù)