PDGF-D基因多態(tài)與腦卒中的關(guān)聯(lián)及功能研究.pdf

1、第一部分PDGF-D單核酸多態(tài)性與腦卒中的關(guān)聯(lián)研究 腦卒中是世界各國致殘率和死亡率均非常高的一類疾病，嚴(yán)重威脅著人類身心健康并給各國帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。研究表明我國是腦卒中的高發(fā)國家，并且腦卒中的發(fā)病率呈不斷上升趨勢。我國腦卒中死亡率約為缺血性心臟病的3倍，其中腦出血約占所有腦卒中的30-50％；而西方人群中缺血性心臟病的死亡率是腦卒中的3～4倍，腦出血只占腦卒中的5％～10％。造成我國腦卒中的死亡率及出血性腦卒中發(fā)病率較高的原

2、因尚不清楚，但遺傳因素及環(huán)境因素在其中可能均起重要的作用。 無論缺血性還是出血性腦卒中均存在共同的發(fā)病基礎(chǔ)——腦動(dòng)脈粥樣硬化。目前公認(rèn)損傷應(yīng)答學(xué)說(炎癥學(xué)說)是動(dòng)脈粥樣硬化重要的發(fā)病機(jī)制。已知腦卒中屬于多基因復(fù)雜疾病，單核苷酸多態(tài)性(SNPs)研究方法為復(fù)雜疾病的遺傳學(xué)研究提供了新的思路。SNPs可以作為基因標(biāo)志，用于基因組范圍內(nèi)的關(guān)聯(lián)定位研究來發(fā)現(xiàn)復(fù)雜多基因疾病的易感位點(diǎn)，對(duì)探討這些多基因復(fù)雜疾病的病因、發(fā)病機(jī)制、診斷、預(yù)后評(píng)

3、價(jià)甚至治療均具有重要指導(dǎo)意義。目前已有研究提示血小板源性生長因子D(platelet-derivedgrowthfactorD，PDGF-D)可能參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程，因而可能與腦卒中的發(fā)病有關(guān)。本研究以PDGF-D作為腦卒中發(fā)病的候選基因，利用病例對(duì)照研究模式來探討-858A/C和+3166C/G位點(diǎn)在腦卒中發(fā)病機(jī)制中的作用。 本研究隨機(jī)入選200例腦卒中患者和132例健康對(duì)照。采用限制性長度片段多態(tài)性(RFLP)方

4、法分別分析PDGF-D-858A/C和+3166C/G位點(diǎn)的基因型。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，2個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率在腦卒中組和對(duì)照組的分布均無顯著性差異(P＞0.05)。進(jìn)一步以腦卒中為因變量，以年齡、吸煙、血壓、血糖、TG等其它傳統(tǒng)的心腦血管疾病危險(xiǎn)因素以及基因型作為自變量，用多元logistic回歸模型分析了PDGF-D基因SNPs與腦卒中患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)校正了傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素及-858A/C的影響后，+3166C/

5、G位點(diǎn)C基因型與腦卒中患病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)(OR：0.211；95％CI：0.055-0.815；p=0.024)。而校正了傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素及+3166的影響后，仍不能發(fā)現(xiàn)-858位點(diǎn)與腦卒中的發(fā)生顯著相關(guān)(p=0.057)。通過計(jì)算PDGF-D基因-858A/C和+3166C/G兩個(gè)位點(diǎn)之間的連鎖不平衡程度，發(fā)現(xiàn)存在連鎖不平衡。利用這2個(gè)SNPs位點(diǎn)構(gòu)建單體型，分析表明在腦卒中與對(duì)照組之間單體型頻率的分布存在顯著性差異(p＜0.001)。

6、 以野生單體型CC(-858A/C/+3166C/G)作為參照，進(jìn)一步比較每種單體型在兩組之間的頻率差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單體型C-G在腦卒中組的頻率(25.7％)顯著高于對(duì)照組中的頻率(10.7％)(OR：3.263；95％CI：1.724-6.179；p＜0.0001)，提示該單體型是腦卒中的危險(xiǎn)因素。 第二部分PDGF-D-858A/C多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄活性的影響 血小板源性生長因子D(PDGF-D)是成纖維細(xì)胞、平

7、滑肌細(xì)胞及間葉細(xì)胞的強(qiáng)有絲分裂原和化學(xué)驅(qū)動(dòng)劑，另外還具有調(diào)控間葉細(xì)胞包括血管平滑肌細(xì)胞(SMCs)增殖和遷移的重要作用。目前有研究證實(shí)PDGF-D與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并且PDGF-D可刺激體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞增殖及參與新生血管成熟過程，因此PDGF-D基因表達(dá)改變可能與心腦血管疾病的發(fā)生以及預(yù)后存在密切聯(lián)系。-858A/C基因多態(tài)位點(diǎn)位于PDGF-D基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游，不同基因變異可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的

8、改變。本研究試圖對(duì)這一多態(tài)性位點(diǎn)的功能進(jìn)行探討。 采用PCR方法擴(kuò)增人PDGF-D上游約1.3kb啟動(dòng)子序列，克隆至熒光素酶表達(dá)載體pGL3basic載體，構(gòu)建不同基因型的PDGF-D特異性表達(dá)載體，重組子經(jīng)雙酶切、測序鑒定。將兩種載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HCT-116細(xì)胞株，應(yīng)用雙熒光素酶測定系統(tǒng)檢測熒光素酶的表達(dá)活性。結(jié)果表明，與野生型pGL3-C比較，pGL3-A轉(zhuǎn)染116細(xì)胞的熒光素酶表達(dá)水平增加3.78倍，t檢驗(yàn)有顯著性意義