PDGF-D在轉(zhuǎn)移性骨腫瘤中對(duì)破骨樣細(xì)胞分化成熟影響的研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　諸多惡性腫瘤,如肺癌,乳腺癌,前列腺癌,甲狀腺癌等,于疾病晚期常常發(fā)生腫瘤骨轉(zhuǎn)移,并多表現(xiàn)為溶骨性骨破壞從而引發(fā)眾多種嚴(yán)重并發(fā)癥,如骨質(zhì)疏松、進(jìn)行性頑固性骨痛、病理性骨折、脊髓壓迫綜合征、高鈣血癥等,這些并發(fā)癥在生理和心理上嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量,降低了5年幸存率。因此,對(duì)于如何能更好的預(yù)防和治療轉(zhuǎn)移性骨腫瘤疾病成為亟待解決的重要問(wèn)題之一。
　　腫瘤骨轉(zhuǎn)移發(fā)生時(shí)基于脫落的具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)包括浸

2、潤(rùn)、轉(zhuǎn)移在內(nèi)的一些復(fù)雜、有序的過(guò)程,而后定植于正常的骨組織,隨后它在此特定的骨微環(huán)境中分泌一系列細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等,包括甲狀旁腺相關(guān)蛋白(Parathyroid Hormone-Related Protein,PTHrP)、白細(xì)胞介素-1/6/8/11(interleukin,IL-1/6/8/11)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、腫瘤壞死因子-α(tumor necro

3、sis factor,TNF-α)等,進(jìn)而破壞正常的成骨細(xì)胞(Osteoblasts,OBs)和破骨細(xì)胞(Osteoclasts,OCs)間的動(dòng)態(tài)的生理平衡,使得宿主OCs過(guò)度活化、成熟,而OBs的生長(zhǎng)則受到抑制,從而引起嚴(yán)重的溶骨性反應(yīng)。接下來(lái),骨組織的溶解使得大量生長(zhǎng)因子,如胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor,IGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,FGF)

4、、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等釋放至骨微環(huán)境中,被腫瘤細(xì)胞加以利用,從而促進(jìn)自身的進(jìn)一步定植與增殖。如果可以打破這種相互作用將會(huì)使得我們更加深入認(rèn)識(shí)轉(zhuǎn)移性骨腫瘤疾病并且有望設(shè)計(jì)出一種特異性的治療方法。

5、　　血小板衍生生長(zhǎng)因子-D(platelet-derived growth factor D,PDGF-D)為PDGF家族新成員,它可以調(diào)節(jié)包括細(xì)胞的增殖、凋亡、變形、遷移、侵襲以及血管生成等在內(nèi)的多個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)程。其通過(guò)與PDGF的酪氨酸激酶受體(即PDGFR-β)結(jié)合,進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞生物學(xué)影響。磷酸化后的PDGF受體可引起一系列下游信號(hào)途徑的級(jí)聯(lián)反應(yīng),包括PI3K、Akt、NF-κB、Notch、ERK等等。PDGF-D廣泛高表達(dá)于多種

6、惡性腫瘤,例如前列腺癌、肺癌、腎細(xì)胞癌、卵巢癌、腦腫瘤、和胰腺癌中,比起PDGF-B,它被認(rèn)為是更好的侵襲性的分子標(biāo)志。在單獨(dú)作用于PDGFR-β后,PDGF-D促進(jìn)了腫瘤的侵犯過(guò)程,增加MMPs的表達(dá),甚至促進(jìn)腫瘤上皮-間質(zhì)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤癌骨轉(zhuǎn)移中,尤其是前列腺,PDGFR-β起到了關(guān)鍵的作用:免疫組化分析顯示,在大多數(shù)前列腺癌腫瘤組織中,包括前

7、列腺癌骨轉(zhuǎn)移灶和原發(fā)灶中,PDGFR-β都有顯著表達(dá),其基因被作為五個(gè)預(yù)示復(fù)發(fā)的標(biāo)志基因之一。同時(shí),PDGF-D的表達(dá)升高與前列腺癌的Gleason評(píng)分以及腫瘤分級(jí)密切相關(guān)。最近,在聯(lián)合免疫缺陷小鼠皮下接種前列腺癌細(xì)胞的一項(xiàng)研究結(jié)果顯示,PDGF-D/PDGFR-β信號(hào)系統(tǒng)的激活可以促進(jìn)皮下腫瘤的形成,強(qiáng)化了癌細(xì)胞侵犯周?chē)|(zhì)的能力。因此,本課題組推測(cè),在腫瘤轉(zhuǎn)移至骨的最初階段以及此后的惡性循環(huán)過(guò)程中,PDGF-D/PDGFR-β信號(hào)可

8、能參與了溶骨性破壞的過(guò)程,其參與方式有可能是通過(guò)對(duì)OCs的活化而實(shí)現(xiàn)的。
　　因此,本課題研究擬通過(guò)檢測(cè)PDGF-D在人乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及其受體在人外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中的表達(dá),探究PDGF-D對(duì)OCs活化的可能性;而后通過(guò)引入外源性的PDGF-D因子作用于PBMCs,觀察其對(duì)OCs活化過(guò)程的作用并嘗試評(píng)價(jià)其對(duì)該過(guò)程的影響。從而加深對(duì)PDGF-D以及

9、OCs活化、成熟過(guò)程的認(rèn)識(shí),為進(jìn)一步深入研究其具體的作用信號(hào)路徑與機(jī)制等相關(guān)研究做好實(shí)驗(yàn)參考與理論依據(jù)。
　　方法:
　　第一部分分題一:
　　1、免疫熒光檢測(cè)PDGF-D在人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)。
　　2、Real-timePCR檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞中PDGF-DmRNA的表達(dá)。
　　3、ELISA檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞

10、上清液中PDGF-D蛋白分泌量的情況。
　　第一部分分題二:
　　1、Ficoll法分離獲得PBMCs,并用貼壁培養(yǎng)法純化細(xì)胞。
　　2、免疫熒光檢測(cè)PDGF-D在PBMCs和人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞的表達(dá)。
　　3、Real-time熒光定量PCR檢測(cè)PDGF-DmRNA在PBMCs和MDA-MB-231細(xì)胞的表達(dá)。
　　4、ELISA檢測(cè)PBMCs和系MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)基中PDG

11、F-D蛋白的表達(dá)。
　　5、RT-PCR半定量檢測(cè)PBMCs中PDGFR-α和PDGFR-βmRNA的表達(dá)。
　　6、WesternBlot檢測(cè)PBMCs中PDGFR-α蛋白和PDGFR-β蛋白的表達(dá)。
　　第二部分分題一:
　　1、獲得PBMCs后,實(shí)驗(yàn)分為三組:a、陽(yáng)性對(duì)照組(PCG):RANKL+M-CSF+PBMCs;b、陰性對(duì)照組(NCG):α-MEM培養(yǎng)基+PBMCs;c、實(shí)驗(yàn)組(EG):PDGF-D

12、+PBMCs。
　　2、倒置相差顯微鏡下觀察以上三組細(xì)胞。
　　3、TRAP染色觀察三組細(xì)胞中的細(xì)胞形態(tài)。
　　4、骨吸收實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組細(xì)胞中細(xì)胞的骨吸收能力。
　　5、Real-timePCR檢測(cè)三組細(xì)胞TRAP、CK、MMP-9mRNA的表達(dá)。
　　6、ELISA檢測(cè)第15d三組細(xì)胞上清液中MMP-9蛋的表達(dá)。
　　7、Westernblot檢測(cè)三組細(xì)胞CK蛋白表達(dá)。
　　第二部分分題二:

13、r>　　1、獲得PBMCs后,實(shí)驗(yàn)分三組:a、阻斷組(BG):PBMCs+M-CSF+PDGF-D+PDGF-DAb;b、對(duì)照組(CG):PBMCs+α-MEM培養(yǎng)基;c、誘導(dǎo)組(IG):PBMCs+PDGF-D。
　　2、倒置相差顯微鏡下觀察以上三組細(xì)胞。
　　3、TRAP染色觀察三組中各細(xì)胞形態(tài)。
　　4、骨吸收實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組細(xì)胞中細(xì)胞的骨吸收能力。
　　5、Real-timePCR檢測(cè)三組細(xì)胞TRAP、CK、

14、MMP-9mRNA的表達(dá)。
　　6、ELISA檢測(cè)三組細(xì)胞MMP-9蛋白的表達(dá)。
　　7、Westernblot檢測(cè)三組細(xì)胞CK蛋白表達(dá)。
　　8、以上所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。
　　結(jié)果:
　　第一部分分題一:
　　1、免疫熒光顯示:PDGF-D在人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7的胞漿中表達(dá),并且PDGF-D在MDA-MB-231中的表達(dá)顯著高于其在MCF-7中的表達(dá)(

15、p<0.05)。
　　2、PDGF-DmRNA在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于其在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)(p<0.05)。
　　3、ELISA法檢測(cè)PDGF-D蛋白的表達(dá),獲標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸方程[(Y=0.899X+0.114,R2=0.9994)],PDGF-D在MDA-MB-231細(xì)胞24h和48h兩時(shí)間點(diǎn)均顯著高于MCF-7的表達(dá)(p<0.05)。
　　第一部分分題二:
　　1、通過(guò)Ficoll法

16、獲得PBMCs,純度及數(shù)量均能夠滿足實(shí)驗(yàn)需要。
　　2、免疫熒光顯示:PDGF-D在人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞的胞漿中有明顯表達(dá),而在PBMCs中則未見(jiàn)其表達(dá),僅見(jiàn)藍(lán)染細(xì)胞核。
　　3、Real-Time熒光定量PCR檢測(cè)顯示:PDGF-DmRNA在MDA-MB-231細(xì)胞中有較高表達(dá),而在PBMCs中則未見(jiàn)表達(dá)(p<0.05)。
　　4、ELISA法檢測(cè)PDGF-D蛋白的表達(dá),獲標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸方程[(Y

17、=0.993X+0.139,R2=0.9991)],PDGF-D在MDA-MB-231細(xì)胞在24h和48h兩時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均顯著高于PBMCs相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)(p<0.05)。同時(shí),PDGF-D在PBMCs的表達(dá),在24h和48h無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(p>0.05),且均顯著低于其在MDA-MB-231中的表達(dá)(p<0.05)。
　　5、RT-PCR半定量檢測(cè)顯示:PBMCs中PDGFR-α和PDGFR-βmRNA均有表達(dá),通過(guò)ImageJ

18、軟件分析灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示,PDGFR-βmRNA的表達(dá)量高于PDGFR-αmRNA(p<0.05)。
　　6、Western blot檢測(cè)PBMCs中PDGFR-β蛋白的表達(dá)顯著高于PDGFR-α蛋白的表達(dá)(p<0.05)。
　　第二部分分題一:
　　1、PCG和EG可見(jiàn)破骨樣細(xì)胞(Osteoclast like cells,OLCs),而NCG細(xì)胞胞體小,且為單核。
　　2、TRAP染色:PCG和EG內(nèi)

19、可見(jiàn)大量TRAP陽(yáng)性細(xì)胞,而NCG則未見(jiàn)。
　　3、骨吸收實(shí)驗(yàn):PCG和EG的骨片上均有藍(lán)色或紫色深染的骨吸收陷窩,而NCG則未見(jiàn)。
　　4、NCG的TRAP、CK、MMP-9mRNA的表達(dá)均顯著低于PCG和EG(p<0.05),而其在BG和CG中的表達(dá)無(wú)顯著差異(p>0.05)。
　　5、ELISA法檢測(cè)MMP-9蛋白:PCG和EG的表達(dá)顯著高于NCG(p<0.05),且PCG和EG之間無(wú)顯著差異(p>0.05)。<

20、br>　　6、Western blot檢測(cè)CK蛋白的表達(dá):PCG和EG均顯著高于NCG(p<0.05),而兩組間無(wú)顯著差異(p>0.05)。
　　第二部分分題二:
　　1、IG可見(jiàn)典型OLCs,而B(niǎo)G和CG則未見(jiàn)。
　　2、TRAP染色:IG內(nèi)可見(jiàn)大量TRAP陽(yáng)性細(xì)胞,而B(niǎo)G和CG未見(jiàn)。
　　3、骨吸收實(shí)驗(yàn):IG骨片上可見(jiàn)骨吸收陷窩,而B(niǎo)G和CG均未見(jiàn)。
　　4、Real-timePCR:對(duì)BG和CG的TR

21、AP、CK、MMP-9mRNA的表達(dá)均顯著低于IG(p<0.05),同時(shí)其在BG和CG的表達(dá)無(wú)顯著差異(p>0.05)。
　　5、ELISA法檢測(cè)MMP-9蛋白:BG和CG顯著低于IG(p<0.05),且前兩組之間無(wú)顯著差異(p>0.05)。
　　6、Western blot檢測(cè)CK蛋白表達(dá):BG和CG表達(dá)量均顯著低于IG(p<0.05),且前兩組間無(wú)顯著差異(p>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、PDGF-D在

22、不同轉(zhuǎn)移潛能的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7中均有表達(dá)。
　　2、PDGF-D在PBMCs中未檢測(cè)到表達(dá)。
　　3、在PBMCs中,PDGF-D的特異性受體PDGFR-β的表達(dá)顯著高于PDGFR-α的表達(dá)。
　　4、外源性PDGF-D可在無(wú)RANKL+M-CSF的條件下獨(dú)立誘導(dǎo)PBMCs分化為破骨樣細(xì)胞。
　　5、外源性PDGF-D抗體可阻止PDGF-D與其特異性受體PDGFR-β的結(jié)合,從而阻斷P