PDGF-D通過EMT參與吉西他濱在肝細胞癌中的耐藥機制研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱“肝癌”）是臨床上最為常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度高，難以早期發(fā)現(xiàn)，且預(yù)后極差，嚴重威脅著我國人民的健康。全身化療是晚期HCC的重要治療方法，傳統(tǒng)細胞毒藥物所帶來的臨床獲益有限，而新型細胞毒藥物如奧沙利鉑（OXA）、吉西他濱（Gemcitabine，GEM）顯示出一定的前景，但這類藥物依然會遭遇獲得性耐藥而導致治療失敗。
　　上皮

2、間質(zhì)樣改變（Epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞轉(zhuǎn)變成間質(zhì)細胞并獲得遷移侵襲能力的過程，該過程與腫瘤耐藥密切相關(guān)，其中，血小板源生長因子-D（Platelet-derived growth factor-D，PDGF-D）在誘導EMT的發(fā)生過程中扮演關(guān)鍵角色。
　　我們在前期的工作中，誘導建立了GEM耐藥的肝癌耐藥（GR）細胞(分別稱為HepG2 GR和SMMC-7721

3、GR)，與親本細胞（HepG2和SMMC-7721）相比，發(fā)現(xiàn)耐藥細胞可能發(fā)生了EMT形態(tài)改變，并發(fā)現(xiàn)PDGF-D在肝癌GEM耐藥細胞中過度表達。本研究以耐藥細胞為模型，考察PDGF-D是否通過EMT導致肝癌細胞獲得耐藥表型，以揭示肝癌細胞對GEM耐藥的分子機制，為克服肝癌對GEM耐藥提出理論依據(jù)和治療策略。
　　方法：
　　1.制備肝癌細胞系HepG2和SMMC-7721的GEM耐藥細胞：利用濃度梯度遞增法建立了HepG2

4、 GR和SMMC-7721 GR細胞，并用MTT法測定耐藥水平。
　　2.觀察HepG2、HepG2 GR細胞和SMMC-7721、SMMC-7721 GR細胞的形態(tài)；通過細胞劃痕實驗，遷移侵襲分析，Attachment、Detachment實驗考察耐藥細胞的生物學活性；qRT-PCR、Western-Blot測定 EMT分子標志物 E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白(Vimentin)、Snail、Slug的表達。<

5、br>　　3.以qRT-PCR和Western-Blot測定肝癌親本和耐藥細胞中的PDGF-D及其受體PDGFRβ的表達。
　　4.以小干擾 RNA(Small interfering RNA，siRNA)技術(shù)瞬時沉默耐藥細胞中PDGF-D的表達，考察PDGF-D基因敲除對耐藥細胞生物學行為和EMT表型分子的改變。
　　結(jié)果：
　　1.與親代細胞相比，耐藥細胞呈現(xiàn)出 EMT形態(tài)學改變：細胞極性消失，偽足增多，呈拉長的不

6、規(guī)則的成纖維細胞狀；耐藥細胞遷移侵襲能力增加，粘附脫附能力增強，具有較典型的EMT生物學特征；E-Cadherin等上皮表型分子表達顯著下調(diào)，Vimentin、Snail和Slug等間質(zhì)分子表達顯著上調(diào)；
　　2.肝癌耐藥細胞PDGF-D和PDGFRβ的表達顯著上調(diào)。
　　3.干擾PDGF-D后，耐藥細胞呈現(xiàn)出類圓形，很少有偽足形成；細胞遷移侵襲能力降低；E-Cadherin表達顯著上調(diào)，Vimentin、Snail、Slu