鞘內(nèi)注射NMDA受體激動劑NMDA上調(diào)大鼠脊髓后角環(huán)氧化酶-2的表達(dá).pdf

1、目的：前列腺素(prostaglandins，PGs)，特別是前列腺素E2和前列環(huán)素是重要的炎癥、疼痛和發(fā)熱介質(zhì)。環(huán)氧化酶(cyclooxyganese，COX)是合成PGs的限速酶。在傷害性刺激傳入引起痛及痛過敏時，COX-2和PGs發(fā)揮重要的作用。例如，預(yù)先口服或鞘內(nèi)給予COX-2抑制劑均可以劑量依賴的方式產(chǎn)生抗傷害性感受作用。應(yīng)用免疫組織化學(xué)、Westernblot等方法的研究顯示，在大鼠外周炎性痛及痛過敏模型中，脊髓中COX-2

2、蛋白表達(dá)增加，進(jìn)一步證實(shí)了COX-2及其催化產(chǎn)生的PGs在脊髓傷害性信息傳遞中的重要作用。但是，在這一過程中脊髓COX-2表達(dá)增多的機(jī)制尚不完全清楚。 大量證據(jù)表明，興奮性氨基酸(excitatory amino acids.EAAs)及其受體，特別是N-methyl-D-aspartate(NMDA)受體在脊髓傷害性信息的傳遞中發(fā)揮重要作用。同時，有資料顯示，傷害性傳入引起的痛及痛過敏過程中脊髓后角COX-2表達(dá)的增加可能與N

3、MDA受體的激活有關(guān)。例如，在白陶土和角叉菜膠以及福爾馬林等誘發(fā)的痛及痛過敏過程中，大鼠脊髓谷氨酸和PGE2的釋放都增加；NMDA受體拮抗劑和選擇性COX-2抑制劑均能顯著降低福爾馬林實(shí)驗(yàn)的疼痛行為；鞘內(nèi)給予NMDA引起的傷害性感受，可劑量依賴性的被鞘內(nèi)或全身給予選擇性COX-2抑制劑所抑制。 我室最近應(yīng)用免疫組化技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，給大鼠足底注射福爾馬林或鞘內(nèi)注射NMDA受體激動劑NMDA誘導(dǎo)大鼠傷害性感受的同時，使脊髓后角COX-

4、2表達(dá)增加。預(yù)先鞘內(nèi)注射NMDA受體非競爭性抑制劑MK-801可抑制COX-2表達(dá)的上調(diào)。初步提示NMDA受體的活動是介導(dǎo)炎性痛及痛過敏過程中脊髓后角COX-2表達(dá)增加的原因之一。本課題則在此基礎(chǔ)上，采用Western blot和RT-PCR技術(shù)，進(jìn)一步觀察鞘內(nèi)注射NMDA受體特異性激動劑NMDA對COX-2蛋白和mRNA表達(dá)的影響，為闡明NMDA受體激活在傷害性信息傳入引起脊髓后角COX-2表達(dá)增多中的作用提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

5、 方法：雄性Spague-Dawley大鼠110只，體重280±20克，隨機(jī)分為以下各組： sham組：鞘內(nèi)注射生理鹽水10μl。于相應(yīng)時間點(diǎn)取材觀察。 NMDAI組：鞘內(nèi)注射NMDA溶液10μl。根據(jù)NMDA的注射劑量，進(jìn)一步分為0.1 nmol，1 nmol，10 nmol三個亞組。各組動物于鞘內(nèi)注射后4小時取材，觀察NMDA上調(diào)脊髓后角COX-2表達(dá)的劑量依賴性。 MK-801+NMDA組：首先鞘內(nèi)注射M

6、K-801生理鹽水溶液10μl(50 nmol)，15 min后鞘內(nèi)注射NMDA溶液10μl(10nmol)，注射NMDA后4小時取材，觀察MK-801對NMDA引起的脊髓后角COX-2表達(dá)上調(diào)的影響。 NMDAⅡ組：鞘內(nèi)注射NMDA 10 nmol，于注射后1 h、2 h、4 h、24 h、36 h、(僅限于Western blot分析)、和3 d(僅限于Western blot分析)，測定熱甩尾潛伏期、熱輻射縮足潛伏期和機(jī)械

7、刺激縮足閾值后取材，觀察鞘內(nèi)注射NMDA后脊髓后角COX-2表達(dá)的時相特點(diǎn)及其與痛覺過敏的時間對應(yīng)關(guān)系。上述各組中，每個亞組10只動物，其中5只用于Western blot檢測脊髓后角COX-2蛋白的表達(dá)，5只用于RT-PCR檢測脊髓后角COX-2 mRNA表達(dá)的變化。 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示。采用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和t檢驗(yàn)，以 (P<0.05)作為判斷差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

8、 結(jié)果： 1、痛行為反應(yīng)大鼠鞘內(nèi)注射NMDA后動物出現(xiàn)了特征性的傷害性行為反應(yīng)，包括緊張性的抓、咬、舔、扭體和吱叫等。 1.1 熱甩尾和熱縮足潛伏期與sham組相比，NMDA 1h組、2 h組、4 h組、以及24 h組的熱甩尾潛伏期明顯縮短(P<0.05)，表明鞘內(nèi)注射NMDA后早期即可出現(xiàn)熱痛覺過敏，并且這種痛覺過敏可持續(xù)較長時間。NMDA 36 h和3 d組的熱甩尾潛伏期已基本恢復(fù)到正常水平，表明鞘內(nèi)NMDA

9、引起的熱痛覺過敏已恢復(fù)。熱縮足潛伏期的變化特點(diǎn)與熱甩尾相類似。 1.2 機(jī)械縮足反射閾值與sham組相比，大鼠鞘內(nèi)注射NMDA后1 h機(jī)械縮足反射閾值即已明顯降低，這一降低可持續(xù)至鞘內(nèi)注射NMDA后36 h，表明鞘內(nèi)注射NMDA后早期即可出現(xiàn)機(jī)械痛覺過敏，并且這種痛覺過敏可持續(xù)較長時間。NMDA 3d組與sham相比無顯著性差異，表明鞘內(nèi)注射NMDA引起的機(jī)械痛敏已恢復(fù)。 2、鞘內(nèi)注射NMDA上調(diào)脊髓后角COX-2的表達(dá)

10、隨大鼠鞘內(nèi)給予NMDA劑量的增加(0.1 nmol，1 nmol和10nmol)，脊髓后角COX-2蛋白和mRNA的表達(dá)逐漸升高，呈明顯的劑量依賴性(P<0.05)。預(yù)先鞘內(nèi)注射NMDA受體阻斷劑MK-801可顯著抑制上述NMDA引起的COX-2表達(dá)的上調(diào)(P<0.05)。 3、鞘內(nèi)注射NMDA引起的脊髓后角COX-2表達(dá)上調(diào)的時間特征與其所引起的痛行為時間特征相一致鞘內(nèi)注射NMDA后2小時，脊髓后角COX-2蛋白的表達(dá)與對照組

11、相比開始增加，4 h達(dá)到高峰，隨后逐漸下調(diào)，至3 d時基本恢復(fù)到sham水平(P<0.05)。鞘內(nèi)注射NMDA后，脊髓后角COX-2 mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)與COX-2蛋白相類似的結(jié)果，但COX-2mRNA表達(dá)上調(diào)的開始時間早于COX-2蛋白，提前至NMDA注射后1 h，同時上調(diào)的mRNA表達(dá)恢復(fù)至sham水平的時間也提前至24 h(P<0.05)。上述COX-2蛋白和mRNA上調(diào)的時間過程與鞘內(nèi)NMDA后痛行為表現(xiàn)的時間特征相吻合。