β激動(dòng)劑直接競爭酶重組受體分析技術(shù)研究.pdf

1、目前，β腎上腺素受體激動(dòng)劑（簡稱β激動(dòng)劑）的違禁添加依然是影響我國畜產(chǎn)品安全的主要因素之一。尤其是混合添加及新型類似物的層出不窮給監(jiān)管帶來巨大挑戰(zhàn)，迫切需要針對該類違禁物的多殘留快速檢測技術(shù)。本研究基于受體識別技術(shù)，克隆得到豬β2AR基因，并進(jìn)行體外表達(dá)體系篩選，以純化的受體蛋白為識別元件，建立了同時(shí)檢測克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等的直接競爭酶受體分析法，研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.豬β2AR基因克隆和序列分析。cDNA和D

2、NA兩序列均為1257 bp，編碼418個(gè)氨基酸，與已發(fā)表豬β2AR序列基本一致，活性位點(diǎn)處的氨基酸均正確克隆。生物信息學(xué)分析可知，克隆基因符合β2AR的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，豬與其它物種的β2AR同源性較高，與領(lǐng)西猯親緣性最為接近。
　　2.豬β2AR基因的最適表達(dá)體系和條件篩選。將野生型和改造后的豬β2AR基因在畢赤酵母X-33菌株、大腸桿菌BL21菌株和哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK293進(jìn)行表達(dá)比較研究及表達(dá)條件的

3、優(yōu)化。經(jīng)SDS-PAGE和Western blot蛋白表達(dá)量檢測，以及ELISA試驗(yàn)蛋白活性鑒定，結(jié)果表明:重組穿梭表達(dá)質(zhì)粒pTriEx-1.1 Hygro-β2AR1-418轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞表達(dá)量較高，表達(dá)產(chǎn)物粗蛋白活性最高，檢測3種β激動(dòng)劑HRP酶標(biāo)記物的OD值分別為0.872、0.652和0.848。因此確定其為最適表達(dá)體系，最佳表達(dá)時(shí)間為轉(zhuǎn)染后72 h。
　　3.受體蛋白制備及純化。經(jīng)裂解和溶膜后制備粗膜蛋白，并進(jìn)一

4、步采用鎳離子親和層析法純化得到受體蛋白。Western blot和SDS-PAGE結(jié)果表明:咪唑的最佳洗脫濃度為250mmol/L，在47KD左右出現(xiàn)了特異性條帶，受體蛋白純度大于80％?；钚澡b定顯示:受體蛋白與3種β激動(dòng)劑的HRP酶標(biāo)記物均能特異性結(jié)合，親和性由強(qiáng)到弱依次為酶標(biāo)克倫特羅＞酶標(biāo)沙丁胺醇＞酶標(biāo)萊克多巴胺。四板細(xì)胞培養(yǎng)皿(15cm)的HEK293細(xì)胞可純化得到160μg受體蛋白，約占粗膜蛋白的4.4％。
　　4.基于重

5、組β2AR受體蛋白的β激動(dòng)劑直接競爭酶受體分析法(ELRA)構(gòu)建。優(yōu)化后的工作條件為:受體蛋白和HRP-克倫特羅分別以1∶10和1∶500倍稀釋，包被液和封閉液分別為碳酸鹽緩沖液（0.05mol/L，pH9.6）和1％ BSA，封閉條件為4℃過夜封閉。包被純化受體蛋白和粗膜蛋白均能實(shí)現(xiàn)對3種β激動(dòng)劑的定量檢測，在1μg/L～1000μg/L濃度范圍內(nèi)，包被受體蛋白的ELRA方法線性關(guān)系更優(yōu)，R2值分別為0.9933，0.9953和0.9

6、966。方法學(xué)評價(jià)結(jié)果顯示，最低檢出限LOD值為4.49μg/L;檢測3種β激動(dòng)劑的IC50值分別為32.13μg/L、96.11μg/L和71.43μg/L，萊克多巴胺和沙丁胺醇與克倫特羅之間的交義反應(yīng)率分別為33.4％和45.0％，說明該方法適于多殘留檢測;豬尿樣品中3種β激動(dòng)劑的平均回收率分別為68.2％、60.3％和65.5％;重復(fù)性試驗(yàn)中變異系數(shù)均小于15％，重復(fù)性較好。
　　綜上所述，本研究建立了檢測尿液基質(zhì)中3種β激