NMDA受體阻斷劑MK-801抑制大鼠甲醛炎性痛及痛過敏時脊髓后角COX-2蛋白及mRNA的表達(dá).pdf

1、目的：前列腺素(prostaglandins，PGs)在脊髓水平傷害性信息的傳遞中發(fā)揮重要作用。環(huán)氧化酶(cyclooxyganese，COX)是合成PGs的限速酶，包括COX-1、COX-2和COX-3三種同工酶。一些研究提示，在傷害性刺激傳入引起痛及痛過敏時，COX-2表達(dá)上調(diào)、催化合成的PGs增多，進(jìn)而促進(jìn)脊髓傷害性信息的傳遞。但是，在此過程中，脊髓后角COX-2的表達(dá)增加的機(jī)制尚不完全清楚。 大量研究表明，興奮性氨基酸(

2、excitatory amino acids，EAAs)及其受體特別是N-methyl-D-aspartate(NMDA)受體與脊髓水平傷害性信息的處理以及痛過敏的形成和維持密切相關(guān)。同時有研究顯示，在傷害性傳入引起的痛及痛過敏過程中脊髓后角COX-2表達(dá)的增加可能與NMDA受體的激活有關(guān)。例如，在痛及痛過敏過程中，大鼠脊髓谷氨酸和PGE2的釋放都增加；鞘內(nèi)給予選擇性COX-2抑制劑能以劑量依賴的方式阻斷NMDA誘導(dǎo)的熱痛敏。

3、我室最近應(yīng)用免疫組化技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，給大鼠足底注射甲醛或鞘內(nèi)注射NMDA受體激動劑NMDA誘導(dǎo)大鼠傷害性感受的同時，使脊髓后角COX-2表達(dá)增加。預(yù)先鞘內(nèi)注射NMDA受體非競爭性抑制劑MK-801可抑制COX-2表達(dá)的上調(diào)。這些結(jié)果初步提示NMDA受體的活動可能是介導(dǎo)炎性痛及痛過敏過程中脊髓后角COX-2表達(dá)增加的原因之一。 本實(shí)驗(yàn)則在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步應(yīng)用Western blot和RT-PCR。技術(shù)，觀察鞘內(nèi)給予NMDA受體拮抗劑

4、MK-801對甲醛實(shí)驗(yàn)大鼠脊髓后角COX-2蛋白及其mRNA表達(dá)上調(diào)的影響，為闡明NMDA受體在介導(dǎo)外周傷害性傳入引起脊髓后角COX-2表達(dá)增加中的作用提供更確切的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：雄性Sprague-Dawley大鼠170只，體重250-280 g，隨機(jī)分為以下各組： sham組：足底皮下注射生理鹽水(normal saline，NS)0.15 ml，按注射后取材觀察的時間，分為1 h、2 h(僅RT-PCR)和1 d組。

5、 甲醛組：大鼠右后足掌面皮下注射5％甲醛0.15 ml，按足底注射后取材觀察的時間，分為1 h、2 h(僅RT-PCR)、4h、1 d和 3 d組。 甲醛+生理鹽水組：首先鞘內(nèi)給予生理鹽水10 μl，15 min后于大鼠右后足掌面皮下注射5％甲醛0.15 ml。按足底注射后取材的時間，分為1 h、2 h(僅RT-PCR)和1 d組。 甲醛+MK-801組：首先鞘內(nèi)給予MK-801溶液10μl，15 min后于大鼠右后足

6、掌面皮下注射5％甲醛0.15 ml，根據(jù)MK-801的注射劑量又分為2 nmol、20 nmol和100 nmol三個亞組。每個亞組按足底注射后取材的時間，再分為1 h、2h(僅RT-PCR)和1 d組。 以上各組動物在預(yù)定時間點(diǎn)取腰5脊髓后角，應(yīng)用Western blot分析(各時間點(diǎn)均為5只動物)和RT-PCR法(各時間點(diǎn)均為5只動物)分別測定腰5(L5)脊髓節(jié)段后角COX-2蛋白和mRMA表達(dá)的變化。1 h取材前測定足底注

7、射甲醛后60min內(nèi)的自發(fā)痛行為反應(yīng)，1 d取材前測定熱輻射縮足反射潛伏期和機(jī)械縮足反射閾值。結(jié)果： 1.痛行為反應(yīng)1.1自發(fā)痛行為反應(yīng)大鼠右后足底注射甲醛后，即刻出現(xiàn)舔、搖、和抬高注射足等自發(fā)縮足痛行為反應(yīng)，注射足自發(fā)痛行為改變呈現(xiàn)明顯的兩時相性。鞘內(nèi)注射MK-801可劑量依賴性地降低大鼠60 min內(nèi)的自發(fā)縮足反射評分(P＜0.05)。 1.2熱輻射縮足潛伏期和機(jī)械刺激縮足閾值與sham組相比，足底注射甲醛1 d后，

8、可引起注射部位熱輻射縮足潛伏期和機(jī)械刺激縮足閾值的升高，而非注射足相應(yīng)部位的熱輻射縮足潛伏期和機(jī)械刺激縮足閾值則降低(P＜0.05)，表明甲醛注射引起了熱痛覺過敏和機(jī)械痛覺過敏(非注射部位)。鞘內(nèi)給予MK-801可顯著抑制甲醛注射引起的熱痛覺過敏和機(jī)械痛覺過敏，表現(xiàn)為甲醛+MK-801各組大鼠非注射足相應(yīng)部位的熱輻射縮足潛伏期和機(jī)械刺激縮足反射閾值較甲醛+生理鹽水組顯著升高(P＜0.05)，并且這種升高與MK-801的劑量呈正相關(guān)。

9、 2甲醛炎性痛及痛過敏上調(diào)脊髓后角COX-2蛋白及mRNA的表達(dá)在Sham組大鼠，可見L5脊髓后角COX-2蛋白及mRNA均有一定程度的表達(dá)。足底注射甲醛后，注射部位同側(cè)的脊髓后角內(nèi)COX-2蛋白的表達(dá)在注射后1 h時即有顯著升高，1 d達(dá)到表達(dá)高峰，3 d恢復(fù)至sham組水平(P＜0.05)。上述COX-2蛋白表達(dá)上調(diào)的時間過程特點(diǎn)與痛行為反應(yīng)呈現(xiàn)相類似的特點(diǎn)COX-2 mRNA表達(dá)的時程與COX-2蛋白相類似，也于注射后1 h開

10、始升高，但表達(dá)高峰提前至注射甲醛后2 h。 3 MK-801抑制甲醛炎性痛引起的脊髓后角COX-2蛋白及mRNA表達(dá)的上調(diào)與甲醛+生理鹽水組相比，甲醛+MK-801組中，無論是注射甲醛后1 h，還是1 d組，大鼠脊髓后角COX-2蛋白及mRNA表達(dá)，以及注射甲醛后2 h時COX-2 mRNA的表達(dá)均顯著降低，表現(xiàn)為COX-2與β-actin的IOD值的比值降低(P＜0.05)，并且MK-801的劑量越大，COX-2蛋白及mRNA表達(dá)的下