Caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO對甲醛炎性痛大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡及痛覺過敏的影響.pdf

1、目的:已有大量的研究結(jié)果表明,神經(jīng)病理性疼痛或外周組織炎癥引起的炎性痛,都可引起機(jī)體發(fā)生熱痛覺過敏和機(jī)械性痛覺過敏現(xiàn)象。痛覺過敏是一種以痛閾降低和/或?qū)φＬ弁创碳さ倪^激反應(yīng)為特點(diǎn)的皮膚感覺異常現(xiàn)象,也稱為痛覺敏感化。痛覺過敏的發(fā)生涉及到外周敏化和脊髓敏化,脊髓神經(jīng)元內(nèi)多種物質(zhì)代謝改變及其引起的神經(jīng)元興奮性改變以及感受野擴(kuò)大在痛覺過敏發(fā)生中起重要作用。
　　 近年來的一些研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),結(jié)扎坐骨神經(jīng)以及外周組織炎性痛可誘導(dǎo)脊髓神

2、經(jīng)元發(fā)生凋亡。我室采用甲醛炎性痛模型,發(fā)現(xiàn)足底注射甲醛溶液后24h,脊髓神經(jīng)元凋亡率即可明顯增加,3天時凋亡達(dá)高峰。這些結(jié)果提示人們思考,疼痛引起的脊髓神經(jīng)元凋亡和痛覺過敏之間是否存在某些關(guān)系,即神經(jīng)元凋亡是否參與痛覺過敏的形成過程?
　　 目前,有關(guān)二者之間關(guān)系的研究已有一些相關(guān)報道,但研究結(jié)果并不一致。有研究報道,大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎后引起的脊髓神經(jīng)元凋亡的程度與機(jī)械性痛覺過敏和熱痛覺過敏程度相一致,但兩者之間是否存在因果關(guān)系尚

3、不能確定。研究者認(rèn)為,二者有可能僅是神經(jīng)病理性疼痛引起的兩種表現(xiàn)形式而己。也有一些研究者采用抗凋亡因子人重組促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,Epo)作為工具藥,觀察神經(jīng)元凋亡與痛覺過敏的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)應(yīng)用Epo可明顯減少神經(jīng)元凋亡,并明顯減弱大鼠的機(jī)械性痛覺過敏程度,因此認(rèn)為,脊髓神經(jīng)元凋亡參與了痛覺過敏的產(chǎn)生。總之,目前有關(guān)神經(jīng)病理性疼痛以及炎性痛引起的神經(jīng)元凋亡是否參與痛覺過敏的發(fā)生尚缺乏足夠的證據(jù)加以確定。
　　

4、 為了明確疼痛引起的神經(jīng)元凋亡是否參與痛覺過敏的產(chǎn)生,本實(shí)驗(yàn)采用甲醛炎性痛模型。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)和末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的d-UTP缺口末端標(biāo)記法(terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated d-UTP nick end-labeling,TUNEL)觀察甲醛炎性痛大鼠鞘內(nèi)注射Caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO對脊髓后角神經(jīng)元凋亡的影

5、響,并通過行為學(xué)方法觀察凋亡抑制劑對甲醛炎性痛大鼠機(jī)械性刺激縮足反射閾值和熱輻射縮足反射潛伏期的影響,探討神經(jīng)元凋亡在痛覺過敏形成過程中的作用。
　　 方法:126只雄性Sprague-Dawley大鼠,體重260-280克,隨機(jī)分為兩大組。
　　 第一大組84只動物,用于觀察Caspase-3抑制劑對脊髓神經(jīng)元凋亡的影響。將動物隨機(jī)分為7個亞組,分別為正常對照組(Control組)、甲醛組(F組)、甲醛+生理鹽水組(F

6、+NS組)、甲醛+0.5 ng Ac-DEVD-CHO組(F+0.5 ng AC組)、甲醛+0.6ng Ac-DEVD-CHO組(F+0.6 ng AC組)、甲醛+0.75 ng Ac-DEVD-CHO組(F+0.75 ng AC組)和甲醛+1 ngAc-DEVD-CHO組(F+1ng AC組),每組12只動物。Control組不做任何處理,直接斷頭取腰4-5脊髓節(jié)段(L4-5)。F+NS組和F+各劑量Ac-DEVD-CHO組均預(yù)先鞘內(nèi)

7、注射NS或不同劑量Ac-DEVD-CHO,30分鐘后足底注射甲醛溶液,各組動物均于足底注射甲醛后72 h斷頭取腰4-5脊髓節(jié)段(L4-5),其中6只行流式細(xì)胞術(shù)檢測神經(jīng)元凋亡率,6只用于TUNEL技術(shù)檢測神經(jīng)元凋亡情況。
　　 第二大組42只動物,用于觀察凋亡抑制劑對甲醛炎性痛大鼠熱輻射縮足反射潛伏期和機(jī)械性刺激縮足反射閾值的影響。實(shí)驗(yàn)動物同樣隨機(jī)分為7個亞組,分別為正常對照組(Control組)、甲醛組(F組)、甲醛+生理鹽水

8、組(F+NS組)、甲醛+0.5 ng Ac-DEVD-CHO組(F+0.5 ng AC組)、甲醛+0.6ng Ac-DEVD-CHO組(F+0.6 ng AC組)、甲醛+0.75ngAc-DEVD-CHO組(F+0.75 ng AC組)和甲醛+1 ng Ac-DEVD-CHO組(F+1ng AC組),每組6只動物。F+NS組和F+各劑量Ac-DEVD-CHO組動物均預(yù)先鞘內(nèi)注射NS或不同劑量.Ac-DEVD-CHO溶液,30分鐘后足底注

9、射甲醛溶液,分別于注射甲醛后1 d、4 d、7 d、10 d和14 d測定大鼠熱輻射縮足反射潛伏期和機(jī)械縮足反射閾值。
　　 結(jié)果:
　　 1 Caspase-3抑制劑對脊髓神經(jīng)元凋亡率的影響
　　 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),Control組大鼠L4-5脊髓節(jié)段神經(jīng)元的凋亡率很低。與Control組相比,F組大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡率明顯升高;F+NS組與F組相比,大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡率無明顯差別,表明鞘內(nèi)注射NS對大鼠脊

10、髓神經(jīng)元凋亡率無明顯影響;F+0.5 ng AC組大鼠和F組大鼠比較,脊髓神經(jīng)元凋亡率無明顯差異,增大Ac-DEVD-CHO劑量,F+0.6 ng AC組,F+0.75 ng.AC組和F+1 ng AC組大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡率均較F組明顯降低,其中F+0.75 ng AC組大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡率降低最為明顯。
　　 2 Caspase-3抑制劑對脊髓神經(jīng)元凋亡指數(shù)的影響
　　 TUNEL技術(shù)檢測脊髓神經(jīng)元凋亡情況發(fā)現(xiàn),凋亡細(xì)

11、胞中含有明顯的棕黃色染色顆粒,這類細(xì)胞形態(tài)多呈不規(guī)則狀。Control組大鼠脊髓后角偶見凋亡細(xì)胞。與Control組相比,F組大鼠脊髓后角中凋亡細(xì)胞數(shù)木明顯增多,凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞比值(即凋亡指數(shù))明顯升高;F+NS組與F組相比,大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡指數(shù)無明顯差異;F+0.5 ng AC組大鼠和F組大鼠比較,脊髓神經(jīng)元凋亡指數(shù)也無明顯差異,但隨著Ac-DEVD-CHO劑量的增大,F+0.6 ng AC組,F+0.75 ng AC組和F+1

12、ng AC組大鼠脊髓凋亡細(xì)胞明顯減少,凋亡指數(shù)與F組相比均明顯降低,其中,以F+0.75 ngAC組大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡指數(shù)降低最為明顯。
　　 3 Caspase-3抑制劑對甲醛炎性痛大鼠熱輻射縮足反射潛伏期和機(jī)械縮足反射閾值的影響
　　 與Control組相比,大鼠右后足底注射5％甲醛后,注射足底在注射甲醛后1 d,4 d,7 d和10 d熱輻射縮足潛伏期均明顯延長,機(jī)械刺激縮足反射閾值也均明顯升高,表明注射足底對熱和

13、機(jī)械刺激反應(yīng)遲鈍,注射甲醛后第14 d時基本恢復(fù)正常。在注射甲醛后1 d,4 d,7 d,10 d和14d,非注射足相應(yīng)足底熱輻射縮足潛伏期則明顯縮短,機(jī)械刺激縮足反射閾值也均明顯降低,表明非注射足發(fā)生了熱和機(jī)械性痛覺過敏。甲醛炎性痛大鼠鞘內(nèi)注射生理鹽水后,大鼠的注射足和非注射足熱輻射縮足潛伏期和機(jī)械刺激縮足反射閾值在各觀察時間點(diǎn)與F組相比均無明顯差異。F+各劑量Ac-DEVD-CHO組與F組相比,注射足熱輻射縮足潛伏期和機(jī)械刺激縮足反

14、射閾值均無明顯變化;而非注射足熱輻射縮足潛伏期和機(jī)械刺激縮足反射閾值隨著Ac-DEVD-CHO劑量的增大,其變化有所不同。分別表現(xiàn)為足底注射甲醛后1 d,各劑量組大鼠與F組大鼠比較,非注射足熱輻射縮足潛伏期和機(jī)械刺激縮足反射閾值均無明顯改變;與F組相比,在各時間點(diǎn)F+0.5 ng AC組大鼠非注射足熱輻射縮足潛伏期和機(jī)械刺激縮足反射閾值均無明顯差異,表明鞘內(nèi)注射0.5 ng AC對大鼠熱輻射縮足潛伏期和機(jī)械刺激縮足反射閾值無明顯影響;與

15、F組比較,F+0.6 ng AC組大鼠僅在注射甲醛后4 d,非注射足熱輻射縮足潛伏期和機(jī)械刺激縮足反射閾值有所升高,而在注射甲醛后7 d,10 d以及14 d,0.6 ng AC對非注射足熱輻射縮足潛伏期和機(jī)械刺激縮足反射閡值影響不明顯;與F組比較,F+0.75 ng AC組和F+1 ng AC組在注射甲醛后4 d,7 d和10 d,大鼠非注射足熱輻射縮足潛伏期均有所升高,機(jī)械刺激縮足反射閾值也明顯升高,以上結(jié)果表明,鞘內(nèi)注射一定量的C

16、aspase-3抑制劑可降低大鼠熱和機(jī)械性痛覺過敏程度。在注射甲醛后14 d,各劑量AC對大鼠非注射足熱輻射縮足潛伏期和機(jī)械刺激縮足反射閾值的影響均消失。
　　 結(jié)論:甲醛炎性痛可誘導(dǎo)大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡并可引起大鼠產(chǎn)生熱和機(jī)械性痛覺過敏,鞘內(nèi)注射一定劑量的Caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO可明顯抑制甲醛炎性痛誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元凋亡,并減輕大鼠熱痛覺過敏和機(jī)械性痛覺過敏程度,提示脊髓神經(jīng)元凋亡途徑可能參與了痛覺過敏的形成