甲醛炎性痛誘導(dǎo)大鼠脊髓HO-1蛋白表達(dá)增加機(jī)制初探.pdf

1、目的：以往的研究己證實(shí)，甲醛炎性痛引起的傷害性信息傳入可誘導(dǎo)脊髓血紅素氧合酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）表達(dá)增多，脊髓內(nèi)HO-1表達(dá)增多以及內(nèi)源性一氧化碳（Carbon monoxide，CO）產(chǎn)生增多在痛感覺和痛覺過敏產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。但甲醛炎性痛引起的傷害性信息傳入誘導(dǎo)的脊髓HO-1表達(dá)增多的機(jī)制尚未見相關(guān)報道。
　　 已有大量的研究資料表明，外周組織炎性痛引起傷害性信息傳入脊髓，可引起初級神經(jīng)元釋放

2、大量的以興奮性氨基酸（excitatory amino acids，EAAs）為主的神經(jīng)遞質(zhì)，其作用于脊髓二級神經(jīng)元受體，引起細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子一氧化氮（nitric oxide，NO）產(chǎn)生增加和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）激活，這些改變均參與痛感知及痛過敏的形成過程。在我室以往的研究中，曾觀察了鞘內(nèi)注射N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體拮抗劑MK-801

3、或PKC抑制劑CH對甲醛炎性痛誘導(dǎo)的脊髓NOS表達(dá)和NO產(chǎn)生的影響，發(fā)現(xiàn)二者均可抑制甲醛炎性痛誘導(dǎo)的脊髓NOS表達(dá)和NO的產(chǎn)生，證明甲醛炎性痛時脊髓后角NO的產(chǎn)生，除受NMDA受體激活狀態(tài)調(diào)控以外，也受胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子PKC的調(diào)控。
　　 目前已證明，NOS/NO和HO/CO兩個系統(tǒng)之間存在著密切的聯(lián)系。大鼠甲醛炎性痛時脊髓內(nèi)HO-1表達(dá)增多是否也與NMDA受體激活以及胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子PKC活化有關(guān)，尚有待進(jìn)一步研究加以證實(shí)。<

4、br>　　 本實(shí)驗通過觀察甲醛炎性痛大鼠鞘給予NMDA受體拮抗劑MK-801以及PKC選擇性抑制劑燈盞花素乙（chelerythrine chloride，CH）及正常大鼠鞘內(nèi)內(nèi)給予NMDA受體選擇性激動劑NMDA以及PKC激動劑佛潑醇脂（Phorbol12-Myrstate-Acetate，PMA），觀察二者對甲醛炎性痛大鼠以及正常大鼠脊髓HO-1表達(dá)的影響，探討甲醛炎性痛誘導(dǎo)的大鼠脊髓HO-1蛋白表達(dá)改變是否受NMDA受體激活以及

5、PKC活化狀態(tài)調(diào)控，探討甲醛炎性痛大鼠脊髓HO-1蛋白表達(dá)增加的機(jī)制。
　　 1.NMDA受體激活在甲醛炎性痛誘導(dǎo)脊髓HO-1蛋白表達(dá)中的作用
　　 方法：雄性Sprague-Dawley大鼠35只，體重280±20g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為5組，分別為：①對照組（Control），②甲醛組（FM），③甲醛+生理鹽水組（FM+NS），④甲醛+MK-801組（FM+MK-801）。⑤NMDA組，每組

6、7只動物，Control組不加任何處理，直接斷頭取脊髓。FM組大鼠于右后掌皮下注射5％甲醛溶液0.2ml，于注射甲醛后24h斷頭取材。FM+NS和FM+MK-801組大鼠分別預(yù)先鞘內(nèi)注射NS或NMDA受體抑制劑MK-801溶液，15 min后于右后掌皮下注射甲醛溶液0.2ml，于注射甲醛后24h斷頭取材。NMDA組為正常大鼠鞘內(nèi)注射NMDA受體激動劑NMDA溶液，于鞘內(nèi)注射后24h時斷頭取材。采用免疫組織化學(xué)方法觀察脊髓HO-1蛋白表達(dá)

7、。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Control組大鼠L5節(jié)段雙側(cè)脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板層HO-1陽性細(xì)胞較少，多呈菱形，一些為圓形或卵圓形，部分細(xì)胞可見明顯的突起及細(xì)長的神經(jīng)纖維，這些細(xì)胞符合神經(jīng)元的形態(tài)特征。
　　 與Control組相比，F(xiàn)M組雙側(cè)脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板層HO-1陽性細(xì)胞的數(shù)目明顯增加（P<0.01），并且這些陽性細(xì)胞的染色深度亦明顯增加（P<0.01），表明甲醛炎性痛可誘導(dǎo)脊髓后角HO-1表達(dá)增加。FM+NS組和FM組兩組

8、相比無顯著性差異，表明鞘內(nèi)注射溶劑NS對HO-1表達(dá)無明顯影響。與FM組比較，F(xiàn)M+MK-801組大鼠雙側(cè)脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板層HO-1陽性細(xì)胞的數(shù)目明顯減少（P<0.01），并且這些陽性細(xì)胞的染色深度亦明顯降低（P<0.01）；表明阻斷NMDA受體，可以明顯抑制甲醛炎性痛誘導(dǎo)的脊髓后角HO-1蛋白的表達(dá)。與Control組相比，正常大鼠鞘內(nèi)注射NMDA溶液后，動物出現(xiàn)了煩躁不安，舔咬物品，抓盒底，自發(fā)退縮等傷害性感受行為。同時大鼠雙側(cè)脊髓

9、后角Ⅰ-Ⅱ板層HO-1陽性細(xì)胞的數(shù)目明顯增多（P<0.01），并且HO-1陽性細(xì)胞染色深度明顯增加，這一結(jié)果進(jìn)一步證明，NMDA受體激活可促進(jìn)脊髓神經(jīng)元HO-1蛋白的表達(dá)。
　　 2.蛋白激酶C活化對甲醛炎性痛誘導(dǎo)的脊髓HO-1蛋白表達(dá)的影響
　　 雄性Spmgue-Dawley大鼠35只，體重280±20克，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供。大鼠被隨機(jī)分為5組：①對照組（Control），②甲醛組（FM），③甲醛+二甲基

10、亞砜組（FM+DMSO），④甲醛+CH組（FM+CH）。⑤PMA組，每組7只動物。對照組不加任何處理，直接斷頭取材。FM組大鼠于右后掌皮下注射5％甲醛溶液0.2ml，于注射甲醛后24h斷頭取材。FM+DMSO組和FM+CH組動物于注射甲醛前15min，鞘內(nèi)分別注射10％二甲基亞砜溶液（DMSO，為CH和PMA溶劑）或10nmol CH，注射甲醛后24h斷頭取材；PMA組為正常大鼠，首先鞘內(nèi)注射含有0.8nmol的PKC激動劑PMA溶液。

11、于鞘內(nèi)注射后24h時斷頭取材。采用免疫組織化學(xué)方法觀察脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板層HO-1蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，F(xiàn)M組和FM+DMSO組大鼠L5節(jié)段兩側(cè)脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板層內(nèi)HO-1陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增加，且染色明顯加深（P<0.01），而FM組和FM+DMSO組兩組相比無顯著性差異（P>0.05），說明鞘內(nèi)注射二甲基亞砜溶液對HO-1表達(dá)無明顯影響。與FM組比較，F(xiàn)M+CH組大鼠脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板層內(nèi)HO-1陽性

12、細(xì)胞的數(shù)目明顯減少，陽性細(xì)胞染色明顯變淺（P<0.01），但仍高于Control組水平。表明抑制PKC活化可以抑制甲醛炎性痛誘導(dǎo)的HO-1蛋白表達(dá)增加。正常大鼠鞘內(nèi)注射PMA后，動物出現(xiàn)了煩躁不安，舔咬物品，抓盒底，自發(fā)退縮等傷害性感受行為。同時脊髓神經(jīng)元HO-1蛋白表達(dá)發(fā)生明顯改變。與Control組相比，PMA組大鼠L5節(jié)段脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板層內(nèi)HO-1陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增多（P<0.01），陽性細(xì)胞平均光密度明顯增加（P<0.05），

13、表明染色明顯加深。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，PKC激活可促進(jìn)脊髓神經(jīng)元HO-1蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 鞘內(nèi)注射NMDA受體拮抗劑MK-801可以抑制甲醛炎性痛誘導(dǎo)的HO-1蛋白表達(dá)增加，正常大鼠鞘內(nèi)注射NMDA受體激動劑NMDA可促進(jìn)大鼠脊髓HO-1蛋白表達(dá)；表明甲醛炎性痛誘導(dǎo)的脊髓HO-1蛋白表達(dá)受NMDA受體調(diào)控。
　　 鞘內(nèi)注射PKC抑制劑CH能抑制甲醛炎性痛誘導(dǎo)的大鼠脊髓HO-1蛋白表達(dá)，正常大鼠鞘內(nèi)