Nrf2和HO-1在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠脊髓中的表達(dá)及依達(dá)拉奉保護(hù)作用的研究.pdf

1、目的:多發(fā)性硬化(multipie sclerosis,MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性脫髓鞘疾病,目前MS的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。近年來(lái),越來(lái)越多的研究表明:氧化應(yīng)激在神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)脫髓鞘及軸突損傷中發(fā)揮著重要的作用。多項(xiàng)研究表明,MS患者及嚙齒動(dòng)物EAE模型中,存在有氧化應(yīng)激反應(yīng)。依達(dá)拉奉是國(guó)內(nèi)近幾年開發(fā)上市的一種新型的小分子自由基清除劑,易透過(guò)血腦屏障,其主要通過(guò)捕獲羥自由基抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、抑制腦細(xì)胞(血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞)

2、過(guò)氧化作用,減輕腦水腫和腦組織損傷。近年來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉可以抑制活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的活性氧簇(ROS)和一氧化氮的產(chǎn)生及iNOS mRNA的表達(dá),并減輕小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡及樹突毒性現(xiàn)象。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為與炎癥性脫髓鞘疾病的發(fā)病有關(guān),因此提示依達(dá)拉奉對(duì)MS可能具有治療價(jià)值。
　　 本研究采用Wistar大鼠建立EAE模型,應(yīng)用不同劑量的依達(dá)拉奉注射液進(jìn)行干預(yù),觀察藥物對(duì)大鼠發(fā)病情況和組織病理改變的影響,并測(cè)定大鼠脊

3、髓中Nrf2及HO-1表達(dá)水平的變化,旨在探討依達(dá)拉奉對(duì)MS的作用及機(jī)制,為臨床實(shí)踐提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1動(dòng)物分組:將90只6-8周齡健康雌性Wistar大鼠,體重180-200g,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、EAE模型組、地塞米松(dexamethasone,DXM)組、依達(dá)拉奉小劑量組(3mg·kg-1·d-1)、依達(dá)拉奉大劑量組(10mg·kg-1·d-1),每組各18只。每組又隨機(jī)分為7天、16天、23天

4、三個(gè)亞組,每個(gè)亞組6只大鼠。
　　 2模型制備:將新鮮豚鼠全脊髓制成勻漿,加上完全福氏佐劑(completeFreund's adjuvant,CFA),佐劑中所含卡介苗的劑量為6mg/ml,充分混合抽打制成油包水乳劑,后按0.5ml/只分別于大鼠四肢足墊和背部皮下注射。藥物治療組于模型制備第一天起給予相應(yīng)劑量的藥物腹腔注射,藥物每天一次持續(xù)給至動(dòng)物處死時(shí)為止。
　　 3神經(jīng)功能評(píng)分:于動(dòng)物免疫誘導(dǎo)當(dāng)日及免疫后每天對(duì)動(dòng)物

5、的體重變化、精神狀態(tài)、活動(dòng)情況進(jìn)行觀察,并對(duì)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分,采用Kono等提出的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):1分:動(dòng)物尾部無(wú)力;2分:尾部無(wú)力+肢體無(wú)力;3分:肢體輕度麻痹;4分:肢體嚴(yán)重麻痹,被動(dòng)翻身后不能復(fù)原;5分:瀕死狀態(tài)。
　　 4組織病理學(xué):在動(dòng)物麻醉狀態(tài)下,快速取其大腦側(cè)腦室周圍及脊髓頸、胸、腰膨大處組織,4％多聚甲醛固定,石蠟包埋,組織切片,HE染色和三色染色在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。
　　 5脊髓中Nrf-2和

6、HO-1表達(dá)的測(cè)定:將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于免疫后第7天、16天、23天時(shí)麻醉后快速取脊髓頸、胸、腰膨大處組織,4％多聚甲醛固定,石蠟包埋,組織切片,應(yīng)用SP法進(jìn)行免疫組化,光學(xué)顯微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞,并計(jì)數(shù)。
　　 結(jié)果:
　　 1動(dòng)物發(fā)病率觀察:依達(dá)拉奉大劑量組和DXM組大鼠的發(fā)病率均低于EAE組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。依達(dá)拉奉小劑量組與EAE組大鼠之間的發(fā)病率差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2行為

7、學(xué)觀察:各組大鼠在發(fā)病高峰期時(shí)神經(jīng)功能評(píng)分比較,依達(dá)拉奉大劑量組、DXM組各大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于EAE組(P＜0.05)。依達(dá)拉奉小劑量組與EAE組之間神經(jīng)功能評(píng)分差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3組織病理學(xué)觀察:在疾病初期,EAE組大鼠組織內(nèi)即出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),且炎性細(xì)胞數(shù)目的多少與疾病嚴(yán)重程度相一致。在發(fā)病高峰期,依達(dá)拉奉大劑量組、DXM組大鼠組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)形成的血管袖套數(shù)目明顯低于EAE組及依達(dá)拉奉小劑

8、量組(P＜0.05);依達(dá)拉奉大劑量組和DXM組,EAE組和依達(dá)拉奉小劑量組大鼠組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)形成的血管袖套數(shù)目差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。疾病緩解期各組大鼠組織(P＞0.05.)。三色染色顯示各組的軸突及髓鞘均發(fā)生破壞,但依達(dá)拉奉大劑量組的軸突及髓鞘損傷較EAE組和依達(dá)拉奉小劑量組輕。
　　 4脊髓中Nrf-2和HO-1的表達(dá):各組大鼠的Nrf-2和HO-1表達(dá)均較對(duì)照組上調(diào),依達(dá)拉奉大劑量組的表達(dá)數(shù)目最高,且與其

9、他組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),EAE組和依達(dá)拉奉小劑量組之間的表達(dá)差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1 EAE大鼠模型中的Nrf-2和HO-1表達(dá)上調(diào),同時(shí)依達(dá)拉奉大劑量治療組的上調(diào)更明顯。
　　 2依達(dá)拉奉可以降低EAE大鼠的發(fā)病率,減輕發(fā)病時(shí)神經(jīng)功能損傷的程度。
　　 3依達(dá)拉奉可以減輕EAE大鼠大腦和脊髓內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的程度。
　　 4依達(dá)拉奉可能是通過(guò)